Газета «Новости медицины и фармации» №1 (745), 2021
Вернуться к номеру
Вакцины против COVID-19 и определение нейтрализующей активности к вирусу SARS-CoV-2 как метод для понимания иммунитета
Авторы: Мельник А.А., к.б.н.
руководитель проекта специализированного медицинского центра «Оптима-фарм», г. Киев, Украина
Разделы: Справочник специалиста
Версия для печати
В мире продолжается пандемия, связанная с коронавирусом COVID-19, что сопровождается значительной заболеваемостью и смертностью. По состоянию на начало января 2021 г. имеется уже более 80 миллионов случаев инфицирования людей и около 2 миллионов смертельных исходов. Согласно современному пониманию течения этой болезни, тяжесть COVID-19 варьирует от бессимптомного течения до летального исхода [1].
Практически все основные производители лабораторного оборудования и тест-систем в мире ответили на этот вызов с рекордной скоростью, что позволило охватить большую часть населения, проведя крупномасштабные лабораторные тестирования и получив, таким образом, очень ценную информацию [2–5]. В свою очередь, разработчики вакцин также приняли быстрые ответные меры. С момента начала пандемии COVID-19 количество разрабатываемых вакцин против вируса SARS-CoV-2 стремительно растет. По данным Всемирной организации здравоохранения, в разработке находятся 173 кандидата, 31 из которых проходит тестирование в клинической фазе (10 вакцин дошли до III фазы), а 142 — в доклинической.
Необходимо отметить, что за последние десятилетия успехи ученых в таких областях, как молекулярная биология, иммунология, биотехнология, и других смежных дисциплинах позволили значительно усовершенствовать подходы к разработке вакцин. Последовательная смена технологий от классических методов до современных представлена на рис. 1 [6].
/8_m.jpg)
Для разработки вакцин против SARS-CoV-2 используются различные платформы [7]. К ним относятся как традиционные технологии производства вакцин, так и инновационные методы, такие как платформы на основе векторов, а также ДНК или РНК. Для разных платформ вакцин требуются разные производственные мощности. Для производства цельновирусных вакцин (живых аттенуированных или цельных инактивированных) следует культивировать большое количество вируса, для чего необходимо соблюдение строгого регулирования по соображениям биологической безопасности. В противоположность вакцинам на основе РНК и ДНК, не требуется биопроизводство микроорганизмов на базе реакторов. Характеристика вакцин против COVID-19 представлена в табл. 1.
/9_m.jpg)
Мировые усилия по созданию безопасной и эффективной вакцины против COVID-19 начинают приносить плоды. В настоящее время во всем мире разрешено производство и применение нескольких вакцин (табл. 2), многие другие остаются в разработке. Для получения подробной информации о статусе той или иной вакцины на сайте https://www.raps.org/news-and-articles/news-articles/2020/3/covid-19-vaccine-tracker предоставлена информация о вакцинах, которые получили разрешение или одобрение регулирующих органов, а также данные о некоторых перспективных кандидатах на ранней стадии разработки. Эта информация обновляется еженедельно.
Однако на сегодняшний день возникает чрезвычайно важный вопрос о том, будут ли пациенты, переболевшие COVID-19, иметь защитный иммунитет и каким образом при использовании вакцины возможно определять нейтрализующие антитела, которые ингибируют вирусную репликацию.
/10_m.jpg)
Необходимо отметить, что показателем того, насколько хорошо работает вакцина, является иммуногенность. Она показывает, какой иммунный ответ вызывает вакцина и как он меняется со временем [12]. При измерении иммуногенности определяется, какие типы иммунных ответов активируются, а также то, как меняется сила иммунного ответа с течением времени. Этот анализ не только дает информацию о том, насколько хорошо работает вакцина, но и может помочь при расчете дозировки препарата и определении оптимального графика вакцинации [13]. В отношении COVID-19 ученые до конца не выяснили, что именно представляет собой эффективный естественный иммунный ответ. Без этого трудно однозначно оценить иммунный ответ, вызванный вакциной. Ориентиром в данном случае могут быть результаты первых исследований, а также знания о других коронавирусах, таких как SARS. В частности, в ходе доклинических исследований было выяснено, что антитела, особенно те, которые способны связаться с S-белком вируса SARS-CoV-2 и не допустить проникновение вируса в клетки, известные как нейтрализующие антитела, являются частью механизма защиты от инфекции. Вместе с тем в настоящее время неизвестно, какой уровень (титр) антител необходим для эффективной защиты. Недавние исследования также показали, что количество нейтрализующих антител, образующихся при естественном иммунитете, может уменьшаться в течение нескольких месяцев. Несмотря на то, что данный вывод не стал неожиданностью, пока неизвестно, какое влияние это окажет на продолжительность иммунного ответа.
Нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2
Антитела к SARS-CoV-2 могут быть направлены на многие кодируемые им белки, включая структурные и неструктурные антигены. До сих пор для серологических исследований в качестве антигенов-мишеней использовались два структурных белка. Один из них — нуклеопротеин (NP), который находится внутри вируса или внутри инфицированных клеток. Однако в связи с тем, что NP защищен от антител вирусной мембраной, является маловероятным, что антитела к NP могут напрямую нейтрализовать SARS-CoV-2. Второй структурный белок, часто используемый в качестве мишени для характеристики иммунного ответа на SARS-CoV-2, — это S-белок (Spike-protein), или белок-шип. S-белок — это большой тримерный гликопротеин, содержащий рецепторсвязывающий домен, который использует вирус для соединения со своим клеточным рецептором, ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ-2). Для вируса SARS-CoV-2 он является основной потенциальной мишенью для нейтрализующих антител [17–19].
S-белок состоит из двух субъединиц — S1 и S2. S1-субъединица взаимодействует с клетками хозяина через рецепторсвязывающий домен (Receptor Binding Domain, RBD) (рис. 2).
/10_m2.jpg)
Рецепторсвязывающий домен связывается с рецептором АПФ-2, тем самым инициируя процесс внедрения вируса в клетку. Антитела, способные связываться с RBD-доменом, могут блокировать контакт с рецептором АПФ-2 и препятствовать проникновению вируса в клетки человека и его последующему размножению. Анти-RBD-антитела являются вируснейтрализующими (рис. 3).
Моноклональные антитела к субъединице S1, демонстрирующие нейтрализующую активность, используются как потенциальные терапевтические средства для лечения COVID-19. Нейтрализующие антитела к S-белку являются ключевым активным компонентом конвалесцентной плазмы, используемой для терапии пациентов с тяжелым течением COVID-19. Многие из разрабатываемых в настоящее время вакцин против COVID-19 направлены на индукцию нейтрализующих антител к S-белку.
S-белок является главной целью для нейтрализующих антител против SARS-CoV-2, и нейтрализующие антитела к S-белку играют ключевую роль в иммунитете к COVID-19. Однако данные научных исследований четко показали, что не все пациенты с COVID-19 вырабатывают детектируемый уровень антител и абсолютно точно не все пациенты вырабатывают нейтрализующие антитела. Даже среди доноров конвалесцентной плазмы около 10 % образцов не имеют детектируемого уровня нейтрализующей активности, что ставит под сомнение терапевтическую эффективность подобной плазмы. Следовательно, для получения желаемых терапевтических эффектов применения конвалесцентной плазмы и для оценки эффективности при разработке вакцин против COVID-19 крайне важно измерение нейтрализующей активности антител.
/10_m3.jpg)
Учитывая гетерогенность иммунного ответа среди пациентов с COVID-19, важно оценить активность нейтрализующих антител как для отдельных пациентов, так и для популяции в целом, чтобы дать ответ на ключевые вопросы об иммунитете к COVID-19, а именно:
1) какой уровень нейтрализующих антител достаточен для обеспечения полной защиты;
2) как долго держится эта защита.
Измерение нейтрализующих антител
Активность нейтрализующих антител обычно измеряется при помощи биологических методов исследования, в которых имитируется вирусная инфекция на культурах клеток. Эти тесты трудо- и времязатратны и имеют низкую производительность. Операционная сложность данных тестов делает невозможным их масштабирование для рутинного тестирования до размеров популяции в целом. Такие тест-системы требуют использования вирусных частиц и живых клеток, что также ограничивает возможность их применения в обычной клинической лаборатории. Поэтому существует четкая необходимость в разработке простых в работе серологических тестов в качестве потенциальных тестов для оценки активности нейтрализующих антител на большой популяции пациентов.
Набор COVID-SeroKlir, Kantaro Semi-Quantitative SARS-CoV-2 IgG Antibody Kit для определения нейтрализующих антител
EKF Diagnostics, глобальная компания по диагностике in vitro, представила один из первых тестов для точного измерения уровней нейтрализующих антител COVID-19 у людей. В отличие от других тестов на антитела, набор для тестирования антител Kantaro COVID-SeroKlir SARS-CoV-2 IgG определяет как наличие, так и конкретное количество человеческих антител IgG к вирусу SARS-CoV-2. Это позволяет использовать широкие возможности при диагностике и лечении COVID-19, такие как предоставление жизненно важных знаний для углубления понимания защитного иммунитета, оценки реакции на вакцины и терапевтического лечения.
Набор Kantaro COVID-SeroKlir представляет собой прямой тест ELISA (Enzyme-Linked Immunosrbent Assay) для количественного определения человеческих антител IgG к вирусу SARS-CoV-2 в образцах сыворотки и плазмы (K2-EDTA/Li-гепарин).
COVID-SeroKlir получил разрешение FDA на использование в чрезвычайных ситуациях (EUA) в ноябре 2020 года (CE — в октябре 2020 года). COVID-SeroKlir продемонстрировал 98,8% чувствительность и 99,6% специфичность для обнаружения антител IgG, специфичных для SARS-CoV-2, против двух вирусных антигенов — полноразмерного S-белка и его рецепторсвязывающего домена. COVID-SeroKlir — это двухэтапный иммуноферментный анализ (ELISA), который может применяться любой лабораторией без необходимости использования специального оборудования.
Набор был использован для клинических исследований на очень разнообразной когорте из более чем 75 000 пациентов, в том числе более 30 000 лиц, у которых был диагностирован COVID-19 (это больше, чем у любого другого теста на COVID-19). Кроме того, тест был независимо проверен рецензируемыми журналами, включая Nature и Science [20, 21], а также Национальным институтом здоровья США (NIH) (рис. 4).
Двухэтапный анализ (RBD ELISA и Spike ELISA)
Шаг 1. RBD ELISA (определение антител к рецепторсвязывающему домену)
Рекомбинантный антиген SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain предварительно нанесен на стенки 96-луночного микропланшета. В лунках планшета при добавлении исследуемого во время первой инкубации происходит связывание антигена с антителами и образование комплекса «антиген — антитело». После промывки в лунки добавляются моноклональные антитела, связанные с ферментом, специфичные к человеческому IgG. После повторной промывки добавляется субстрат. Реакцию останавливают стоп-реагентом и измеряют оптическую плотность (ОП) в каждой лунке на микропланшетном ридере при длине волны 450 нм (рис. 5).
Расчет результатов производится по следующей формуле:
/11_m.jpg)
Образцы, которые имеют измеренное значение выше заранее определенного порога, считаются положительными на первом этапе RBD ELISA и тестируются на втором этапе Spike ELISA.
Шаг 2. Spike ELISA (определение антител к S-белку)
Рекомбинантный белок SARS-CoV-2 Spike предварительно нанесен на лунки 96-луночного микропланшета. При добавлении образца с антителами происходит их связывание с белком SARS-CoV-2 Spike. После отмывки от несвязавшихся компонентов добавляют меченные ферментом моноклональные антитела, специфичные к человеческому IgG. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации SARS-CoV-2 Spike. Сигнал от неизвестных образцов сравнивается с калибровочной кривой для получения окончательного результата в условных единицах на миллилитр (AU/мл) (рис. 6).
/11_m2.jpg)
Интерпретация результатов
На этапе RBD ELISA, если рассчитанное значение CI ≥ 0,70, образец считается положительным и требует подтверждения с помощью Spike ELISA. Если значение CI < 0,70, образец определен как отрицательный. На этапе Spike ELISA результаты отображаются в условных единицах на миллилитр (AU/мл). Значение ниже предела количественного определения (LoQ) считается отрицательным. LoQ составляет 3,2 AU/мл. Значение более 3,2 AU/мл считается положительным. Значения выше аналитического диапазона измерения должны указываться как > 125 AU/мл (табл. 3).
/11_m3.jpg)
Выводы
1. Разработка вакцин против SARS-CoV-2 с использованием различных платформ происходит беспрецедентными темпами.
2. В борьбе с пандемией вакцины считаются наиболее многообещающим подходом.
3. Эпидемиологические исследования на людях показывают, что инфекция SARS-CoV-2 приводит к выработке функциональных нейтрализующих антител, которые связаны с защитой от повторного заражения. Эти наблюдения подтверждают идею о том, что вакцина, вырабатывающая нейтрализующие антитела, может также защитить от последующей инфекции. Считается, что нейтрализующие антитела очень важны для снижения риска заболевания.
4. Первичной антигенной мишенью для вакцин против SARS-CoV-2 является S-белок, который связывается с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2.
5. После доступности и широкого распространения вакцин против SARS-CoV-2 необходимо будет оценить вопросы эффективности, которые не были рассмотрены в клинических исследованиях, включая продолжительность защиты и потенциальную потребность в дополнительных дозах, эффективность в субпопуляциях, не включенных в исследования, и влияние на передачу инфекции в обществе.
6. Тест-системы для определения нейтрализующих антител могут быть дополнительным инструментом, который предоставит важную информацию для понимания защитного иммунитета, оценки реакции на вакцины и терапевтического лечения.
7. Возможно, имеет смысл рассмотреть вопрос о внесении данных о нейтрализующих антителах в паспорт вакцинации против COVID-19.
Список литературы
1. Wu Z., McGoogan J.M. Characteristics of and Important Lessons from the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Outbreak in China: Summary of a Report of 72314 Cases From the Chinese Center for Disease Control and Prevention. JAMA. 2020.
2. Sethuraman N. et al. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. Published online May 6, 2020.
3. Melgaçoa J.G. et al. Protective immunity after COVID-19 has been questioned: What can we do without SARS-CoV-2-IgG detection? Cellular. Immunology. 2020. № 353. Р. 104-114.
4. “Immunity passports” in the context of COVID-19. Scientific Brief. https://www.who.int/news-room/commentaries/detail/immunity-passports-in-the-context-of-covid-19
5. Manners C. et al. Protective Adaptive Immunity Against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronaviruses 2 (SARS-CoV-2) and Implications for Vaccines. Cureus. 2020. № 12(6). Р. e8399.
6. Finco O., Rappuoli R. Designing vaccines for the twenty-first century society. Frontiers in Immunology. January 2014. № 5. Р. 12.
7. Krammer F. SARS-CoV-2 vaccines in development. Nature. 2020. № 586. Р. 516.
8. World Health Organization. Draft landscape of COVID-19 candidate vaccines. htpps://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines. (Accessed on October 20, 2020).
9. Plotkin S., Robinson J.M., Cunnighman G. et al. The complexity and cost of vaccine manufacturing — An overview. Vaccine. 2017. № 35. 4064.
10. Gomes P.L., Robinson J.M. Vaccine Manufacturing. In: Plotkin’s Vaccines. Ed. by S. Plotkin, W. Orendtein, P. Offit, K. Edwards. 7th ed. Elsvier, 2018. 51 p.
11. Zhu F.C., Li Y.H., Guan X.H. et al. Safety, tolerability, and immunogenic of a recombinant adenovirus type-5 vectorred COVID-19 caccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020. № 395. Р. 1845.
12. Hodgson S. et al. What defines an efficacious COVID-19 vaccine? A review of the challenges assessing the clinical efficacy of vaccines against SARS-CoV-2. 2020. Avaliable at: doi.org/10.1016/S1473-3099(20)30773-8, Nov 16 2020.
13. World Health Organisation. Guidelines on clinical evaluation of vaccines: regulatory expectations. 2016. Avaliable at: https://www.who.int/biologicals/BS2287_Clinical_guidelines_final_LINE_NOs_20_July_2016.pdf
14. Wrapp D., Wang N., Corbett K.S., Goldsmith J.A., Hsieh C.-L., Abiona O., Graham B.S., McLellan J.S. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020. № 367. Р. 1260-1263.
15. Letko M., Marzi A., Munster V. Nat. Microbiol. 2020. № 16. Р. 562-569.
16. Amanat F., Krammer F. Immunity. 2020. № 52. Р. 583-589.
17. Brochot E. et al. Anti-Spike, anti-Nucleocapsid and neutralizing antibodies in 1 SARS-CoV-2 hospitalized patients and asymptomatic carriers. MedRxiv preprint. https://doi.org/10.1101/2020.05.12.20098236
18. Liu T. et al. Prevalence of IgG antibodies to SARS-CoV-2 in Wuhan — implications for the ability to produce long-lasting protective anti–bodies against SARS-CoV-2. MedRxiv preprint. https://doi.org/10.1101/2020.06.13.20130252
19. Luchsinger L.L. et al. Serological Analysis of New York City COVID19 Convalescent Plasma Donors. MedRxiv preprint. https://doi.org/10.1101/2020.06.08.20124792
20. Amant F. et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 2020. № 26. Р. 2033-1036.
21. Wajnberg A. et al. Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection persist for months. Science. 2020. 10.1126/science.abd7728.