Газета «Новости медицины и фармации» №12 (733), 2020
Вернуться к номеру
Протромбиназа-индуцированный клоттинговый тест как новый метод для мониторинга антикоагулянтов
Авторы: Мельник А.А.
к.б.н., руководитель проекта специализированного медицинского центра «Оптима-фарм», г. Киев, Украина
Разделы: Справочник специалиста
Версия для печати
Антикоагулянты немедленного действия, такие как гепарины и прямые ингибиторы тромбина, являются одними из наиболее часто применяемых лекарственных препаратов в любой области медицины [1–3]. Общий механизм их действия заключается в ингибировании активированного фактора X (FXа) и/или фактора II (FIIа). Эти препараты выводятся из организма путем метаболических процессов, через почки или печень. Различные факторы (возраст, ожирение), а также сопутствующие заболевания (заболевание почек) могут влиять на фармакодинамику и фармакокинетику антикоагулянтов [4–7]. Имеются данные о передозировке данных препаратов и их накоплении в организме, что приводит к осложнениям в виде кровотечения у пациентов [8, 9]. Вопрос мониторинга для подбора индивидуальной терапии и, соответственно, безопасности обсуждается уже в течение нескольких десятилетий [10]. Низкомолекулярные гепарины (НМГ) и фондапаринкус проявляют свою основную антикоагулянтную активность путем ингибирования FXa антитромбином. Обычные тесты для анализа свертывания, такие как активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ) и тромбиновое время (ТВ), недостаточно чувствительны для мониторинга НМГ в клинически применяемых концентрациях. В связи с этим в лабораторную практику были внедрены две группы специализированных тестов.
1. Амидолитические тесты [14]
Гепарины значительно усиливают инактивацию фактора Xa и тромбина антитромбином III (АТ III). При инкубации плазмы, содержащей гепарин, с очищенным фактором Xa часть последнего инактивируется. Остаточная активность фактора Xa определяется по степени гидролиза хромогенного субстрата. Регистрируют изменение оптической плотности на фотометре при длине волны 405 нм. В зависимости от варианта методики выделяют кинетический и 2-точечный методы определения остаточной активности фактора Xa.
Гепарин (образец) FXa + AT III (избыток) - [FXa – AT III] + FXa (остаток).
FXa (остаток) Хромогенный субстрат - трипептид + краситель.
Фактор Xa добавляется к разбавленному образцу, а специфические пептидные субстраты применяют для определения остаточной (не ингибированной) части добавленного FXa.
2. Клоттинговые (или так называемые хронометрические) тесты [15]
Фактор Xa вместе с фосфолипидами и хлоридом кальция используется для запуска свертывания.
В литературе уже давно обсуждается вопрос о том, необходимо ли контролировать активность анти-Xa для НМГ [16–19]. Все авторы согласны с тем, что лабораторный мониторинг должен проводиться в особых случаях, а именно у пациентов с заболеванием почек, ожирением или недостаточным весом, а также у детей. Однако большинство авторов высказались критически относительно ограниченной предсказуемости результатов хромогенных или клоттинговых тестов в отношении эффективности (антитромботический потенциал) и безопасности (риск кровотечений) исследуемых препаратов.
Нефракционированный гепарин (НФГ) требует мониторинга дозирования из-за его изменчивой фармакокинетики и фармакодинамики [20]. Обычно его контролируют с помощью АЧТВ или активированного времени свертывания (АВС). Результаты анализов зависят от используемых анализаторов и реагентов [21, 22]. Целевые диапазоны АЧТВ (1,5–2,5-кратное увеличение) могут быть связаны с реагентом, используемым в лаборатории. Прямые ингибиторы тромбина (ПИТ) обычно контролируются с помощью АЧТВ. Однако с повышением уровней ПИТ активированное частичное тромбопластиновое время не увеличивается должным образом. Поэтому для оценки ПИТ были разработаны амидолитические методы (анти-IIa активность) и экариновое время свертывания. К сожалению, их рутинное использование в повседневной практике остается ограниченным.
Тест PiCT (протромбиназаиндуцированное клоттинговое время)
Тест PiCT (Pentapharm, Базель, Швейцария) является новым чувствительным методом для мониторинга и оценки действия НФГ, НМГ, фондапаринкуса и ПИТ. До настоящего времени в русскоязычной литературе не были опубликованы данные относительно подробной оценки его компонентов и возможности применения.
Принцип метода
PiCT — это тест на антикоагулянты, который чувствителен к анти-Xa и анти-IIa агентам. Он основан на комбинации фосфолипидов, хлорида кальция и двух очищенных белков: FXa и специфического активатора FV из яда гадюки Daboia russelli (RVV-V) (рис. 1).
В исследуемый образец, содержащий плазму, добавляется реагент R1, содержащий комбинацию определенного количества FXa, фосфолипидов и RVV-V. При измерении непрямых ингибиторов FXа и в случае ингибиторов тромбина (прямых и непрямых) период инкубации составляет 180 с. В течение фазы инкубации RVV-V активирует FV в образце, что обеспечивает немедленное образование протромбиназного комплекса после рекальцификации без необходимости активации FV посредством эндогенных реакций обратной связи, опосредованных тромбином. Протромбиназный комплекс превращает протромбин в тромбин. Как только образуется свободный тромбин, в образце определяется сгусток и регистрируется время его образования. Процедура проведения теста является довольно простой в исполнении и напоминает метод определения АЧТВ (рис. 2).
/3_u.jpg)
Интерпретация результатов теста PiCT
В табл. 1 представлены ожидаемые значения времени свертывания в секундах для пациентов, не получавших антикоагулянтную терапию (нормальная область), и для пациентов, получавших различные антикоагулянты. Время свертывания было измерено в рамках многоцентрового исследования с использованием различных анализаторов (STA®-C, STA®-R, KC-10TM).
/4_u.jpg)
На рис. 3 показаны типичные диаграммы результатов серии разбавлений в клиническом диапазоне для фондапаринукса, данапароида, аргатробана, гирудина и ривароксабана.
/4_u2.jpg)
Ограничения теста PiCT
Дефицит большинства факторов не влияет на определение антикоагулянтной активности. В образцах пациентов с дефицитом антитромбина проявляется снижение антикоагулянтной активности, поэтому время свертывания в образцах с известной концентрацией антикоагулянта ниже, чем ожидается. В образцах с высоким дефицитом фактора V, протромбина и/или фибриногена (ниже 25 % от нормального уровня) время свертывания увеличивается. Волчаночные антикоагулянты также могут приводить к ложному повышению антикоагулянтной активности. Апротинин в плазме в концентрации до 800 CIU/мл не влияет на результат теста, и наоборот, протамин влияет на проведение теста при концентрации 1 МЕ/мл и выше (исследуемая плазма не должна содержать протамин). Реагент R1 (активатор) содержит FXa, который может вызвать эффект переноса. Поэтому очистка дозирующих устройств после этапа пипетирования является обязательной и должна включаться в протокол проведения теста.
Тест PiCT более чувствителен по сравнению с АЧТВ и ПВ для мониторинга антикоагулянтов
В настоящее время имеется четыре коммерчески доступных пероральных анти-Xa лекарственных препарата, а именно: апиксабан, бетриксабан, эндоксабан и ривароксабан. Все используемые препараты имеют фиксированную дозировку, тем не менее их применение может быть связано с потенциальными геморрагическими осложнениями. Хотя ингибирующий эффект фактора Xa считается суррогатным маркером биологического действия этих препаратов, было показано, что профиль ингибирования апиксабана, бетриксабана, эдоксабана и ривароксабана не полностью отражает их биологический спектр. Кроме того, методы определения ПВ и АЧТВ имеют ограниченную чувствительность и зависят от многих других эндогенных факторов.
Время свертывания, индуцированное протромбиназой, является чувствительным тестом для глобального мониторинга антикоагулянтов, включая гепарины и пероральные анти-Xa и анти-IIa препараты. Определение конечной точки на основе образовавшегося сгустка фибрина (окончание реакции) пропорционально активности FXa и FIIa.
Относительная чувствительность PiCT по сравнению с АЧТВ и ПВ в различных образцах представлена в табл. 2 [23].
Тест PiCT по сравнению с АЧТВ и ПВ является наиболее чувствительным при работе с различными образцами. Так, при использовании цельной крови и плазмы PiCT показал линейность и высокую чувствительность для всех четырех анти-Ха препаратов. В тесте PiCT (плазма с добавленными лекарственными препаратами) отмечен самый высокий ответ по сравнению с плазмой и цельной кровью, что свидетельствует о различном связывании этих препаратов с клетками, поэтому PiCT можно успешно использовать для мониторинга анти-Ха препаратов. Тест PiCT проводится на всех доступных в настоящее время оптических и механических коагулометрах, которые используются для исследования свертывания крови. Благодаря быстрому времени проведения исследования, высокой чувствительности и более низкой стоимости данный тест может применяться для рутинного мониторинга антикоагулянтной терапии.
/4_u3.jpg)
Заключение
Протромбиназа-индуцированное клоттинговое время — это новый метод анализа системы свертывания крови (гемостаза), предназначенный для мониторинга различных антикоагулянтов. Данный тест чувствителен к анти-Ха и анти-IIa агентам. Процедура выполнения PiCT аналогична тесту для АЧТВ.
Список литературы
Список литературы находится в редакции