Газета «Новости медицины и фармации» №1 (713), 2020
Вернуться к номеру
Альтернативные гликированному гемоглобину (HbA1c) маркеры контроля сахарного диабета
Авторы: Мельник А.А., к.б.н.
руководитель проекта специализированного медицинского центра «Оптима-фарм», г. Киев, Украина
Разделы: Справочник специалиста
Версия для печати
Сахарный диабет (СД) — это хроническое метаболическое заболевание, вызванное абсолютной или относительной недостаточностью инсулина, нарушением чувствительности тканей к инсулину, что проявляется гипергликемией. В настоящее время заболеваемость СД приобрела характер эпидемии и является проблемой для здравоохранения во всем мире. Сейчас, по статистическим данным, 415 миллионов человек болеют СД. По прогнозу Международной федерации диабета (IDF), к 2040 году количество больных составит 642 миллиона [1, 2].
Основной причиной развития осложнений СД является поражение сосудов. Прежде всего страдает микроциркуляция, т.е. нарушается кровоснабжение по мельчайшим сосудам. Симптомы диабетических нарушений проявляются в виде нефропатии, ангиопатии, ретинопатии, нейропатии. Эти симптомы обнаруживаются слишком поздно, что обрекает человека на гибель или в лучшем случае на инвалидность. Несмотря на то что уровень глюкозы является основным фактором и диагностическим маркером для СД, существует жизненно важная необходимость на время забыть о глюкозе и искать дополнительные биомаркеры, которые могли бы лучше диагностировать СД с безошибочной точностью, а также прогнозировать риск развития этого заболевания [3].
Повышение концентрации глюкозы в крови значительно увеличивает ее поступление в клетки за счет инсулиннезависимых механизмов. В результате этого неферментативно происходит гликирование таких белков, как гемоглобин, альбумин, трансферрин, аполипопротеинов, коллагена, белков эндотелия, хрусталика и некоторых других. Степень гликирования разных белков неодинакова и в каждом случае зависит не столько от степени повышения концентрации глюкозы, сколько от времени жизни конкретного белка, т.е. от скорости его обновления. В медленно обменивающихся, или т.н. долгоживущих, белках накапливается больше модифицированных аминогрупп, а в короткоживущих — меньше. Поэтому при присоединении глюкозы функции белка могут нарушаться из-за изменения заряда белковой молекулы, нарушения ее конформации или по причине блокирования активного центра. Это приводит к многочисленным осложнениям диабета. Гликированный гемоглобин (HbA1c) — самый значимый параметр, используемый в повседневной клинической практике, или золотой стандарт для гликемического контроля. HbA1c является эталонным тестом для гликемического мониторинга, так как он напрямую отражает среднюю гликемию и имеет сильную корреляцию с отдаленными осложнениями СД [4, 5].
Преимущества использования теста HbA1c
HbA1c, являющийся адекватным показателем уровня гликемии, позволяет хорошо оценивать риск развития осложнений. Тест стандартизирован, стабилен, имеет низкую вариабельность. Нет необходимости частых измерений и проведения измерений исключительно натощак. Содержание HbA1c не зависит от питания, времени суток, приема лекарственных препаратов, физических нагрузок, стресса. Так как период полужизни эритроцитов составляет 60 суток, то этот параметр принимают как усредненную характеристику, отражающую карбогидратный баланс в течение предыдущих 2 месяцев в виде усредненной ежедневной концентрации глюкозы.
Ограничения теста HbA1c
Хотя тест HbA1c используется в диабетологии с 1976 г., он имеет определенные ограничения [6–8]. Так, с учетом возраста и индекса массы тела (ИМТ) более высокие значения HbA1c наблюдаются у мужчин (на 0,3 %) и женщин (0,4 %) негроидной расы без диабета по сравнению с мужчинами и женщинами европеоидной расы [9]. Переменные, которые могут влиять на гликемию (возраст, пол, ИМТ, давление крови, пре- и постпрандиальная гликемия, деятельность β-клеток, инсулинорезистентность, уровень гематокрита), были рассмотрены при использовании метода множественной линейной регрессии. Показано, что афро- и латиноамериканцы имели более высокие уровни HbA1c по сравнению с европейцами [10]. Ложное повышение HbA1c наблюдалось у пациентов с дефицитом витамина В12, фолиевой кислоты, железодефицитной анемией, при хронической болезни почек, гипербилирубинемии, при приеме в больших дозах ацетилсалициловой кислоты, у лиц, употребляющих опиаты, у пациентов после спленэктомии и с патологической структурой эритроцитов. А ложное снижение отмечено у пациентов, которые получали препараты железа, витамин В12, фолиевую кислоту, эритропоэтин, витамины С и Е. Похожие эффекты отмечены у пациентов с укороченной продолжительностью жизни эритроцитов — при массивных кровопотерях, гемолитической анемии, гемоглобинопатии, спленомегалии, у хронических алкоголиков, пациентов с гипертриглицеридемией, ревматоидным артритом, у пациентов на ретровирусной терапии [11–16].
Фетальный гемоглобин (HbF) является основным гемоглобином во время внутриутробного развития и составляет до 90 % при рождении. В течение первого года жизни HbF снижается до значений, наблюдаемых у взрослых, что составляет примерно 1 %. Увеличение HbF может происходить при патологических состояниях, таких как лейкемия, анемия, талассемия или при наследственной персистенции фетального гемоглобина, в результате чего его значения достигают 30 % [17]. Это состояние является бессимптомным, что может повлиять на результаты HbA1c. Более того, HbA1c не является хорошим маркером контроля гликемии у детей с неонатальным диабетом из-за присутствия фетального гемоглобина [18]. Ложное снижение значения HbA1c может возникнуть у пациентов с диабетом и нарушенными функциями почек, что связано с уменьшением продолжительности жизни эритроцитов при использовании препаратов рекомбинантного человеческого эритропоэтина или при лечении железом. Уремия, изменения рН крови или наличие карбамилированного гемоглобина, а также необходимость трансфузии у пациентов с прогрессирующим повреждением почек приводят к снижению значений HbA1c независимо от изменений уровня гликемии [19–22].
Факторы, влияющие на результаты теста HbА1c, представлены в табл. 1.
/8_u.jpg)
Необходимо отметить, что тест HbA1c является широко распространенным в клинической практике для осуществления мониторинга уровня глюкозы в крови больных СД. Однако в ряде случаев, когда проведение его затруднено по различным причинам, могут довольно успешно использоваться другие тесты. Так, на практике используются такие тесты, как фруктозамин, гликированные сывороточные белки (GSP) и гликированный альбумин (ГА).
1. Фруктозамин
Фруктозамин образуется в процессе неферментативного гликозилирования карбонильной группы глюкозы с аминогруппами циркулирующих сывороточных белков, в основном альбуминов. В связи с более коротким периодом полужизни сывороточных белков по сравнению с продолжительностью жизни эритроцитов концентрация фруктозамина является краткосрочным маркером и позволяет проводить ретроспективную оценку концентрации глюкозы за период 10–14 дней, а по данным некоторых авторов — за 21 день [23], что служит альтернативой, когда результаты HbA1c не могут быть достоверными. Это также полезно при мониторинге пациентов с гестационным диабетом, поскольку данный тест показывает динамику изменения и контроля гликемии за короткий промежуток времени. Тем не менее фруктозамин не является идеальным маркером, так как на него влияют изменения концентрации сывороточных белков, дислипопротеинемии. Ложное снижение фруктозамина может быть связано с более низким уровнем белка и/или альбумина в результате потери белка с мочой, например при нефротическом синдроме, при нарушении поглощения белка в пищеварительном тракте, например при мальабсорбции или нарушении синтеза белка при циррозе печени [24]. Данный тест не выполняется, если концентрация альбумина в сыворотке ниже 30 г/л. Фруктозамин используется реже из-за его более низкой чувствительности, зависимости от концентрации белка в крови и метаболизма веществ, уровня гидратации, концентрации билирубина в сыворотке или гемолиза [25]. Тем не менее различные исследования у лиц с хронической болезнью почек (стадии 3 и 4) показали хорошую корреляцию между уровнем фруктозамина и гликемией у диабетических пациентов и у пациентов, находящихся на гемодиализе, между уровнями фруктозамина и HbA1c [26, 27].
Метод определения фруктозамина
Гликированные белки крови способны превращать NBT (нитросиний тетразолий) в щелочной среде в формазан с образованием пурпурного окрашивания с максимумом поглощения при λ = 530 нм. Для определения фруктозамина используют стабильный NBT-реагент и калибратор на основе человеческой сыворотки (рис. 1). Образец добавляют к реагенту и инкубируют. После 10 и 15 мин измеряют абсорбцию. Изменения в абсорбции сравнивают со стандартом и рассчитывают концентрацию фруктозамина. Референсные значения для женщин — 161–351 мкмоль/л, для мужчин — 118–282 мкмоль/л.
Применение теста для определения фруктозамина, а не гликированного гемоглобина является более эффективным в следующих случаях:
- при внесении резких изменений в план лечения СД фруктозамин позволяет оценить эффективность применяемой коррекции лечения в течение нескольких недель вместо нескольких месяцев (рис. 2);
/9_u.jpg)
- в период беременности больных СД, когда в организме матери происходят значительные изменения, контроль уровня глюкозы приобретает особенно важное значение. Анализ на фруктозамин можно проводить одновременно с анализами на глюкозу, чтобы правильно подобрать дозу инсулина;
- при снижении количества эритроцитов тест на HbA1c не будет достаточно точным (гемолитическая анемия или кровопотери). Присутствие некоторых форм гемоглобина также может оказывать влияние на применяемые методы его измерения.
В таких случаях фруктозамин является единственным показателем, адекватно отражающим уровень глюкозы в крови (табл. 2).
Метод для определения фруктозамина на основе колориметрического теста с использованием нитросинего тетразолия применяется в повседневной лабораторной практике. Однако на его концентрацию влияют витамин С, билирубин и глутатион. Это в конечном итоге приводит к неточным результатам.
/9_u2.jpg)
2. Гликированные сывороточные белки (GSP)
С учетом недостатков теста для определения фруктозамина с использованием нитросинего тетразолия был разработан альтернативный, простой, чувствительный и быстрый тест для контроля гликемии, в котором используется высокоспецифичный фермент фруктозиламинооксидаза для элиминирования интерферирующих веществ. Набор под названием Glycated Serum Protein LiquiColor® Assay (EKF Diagnostics Inc., Taxas, USA) специфичен для всех гликированных белков, включая альбумин, гемоглобин и др. белки.
Новый анализ гликированных белков сыворотки LiquiColor получил одобрение FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств, США), Европейского союза (имеет знак CE).
Референсные значения гликированных сывороточных белков представлены в табл. 3.
Гликированный пробел
Исследования показывают, что комбинация результатов GSP с измерением HbA1c обеспечивает лучшую оценку риска долгосрочного осложнения диабета. GSP заполняет пробел в гликировании, который представляет собой разницу между фактически измеренным значением HbA1c и предсказанным HbA1c значением гликированного белка в сыворотке крови, позволяя обеспечить улучшение прогностичности диабетических осложнений (рис. 3). Это дает возможность надежно прогнозировать осложнения диабета, включая нефропатию и ретинопатию.
GSP как гликемический маркер может использоваться у пациентов при следующих клинических состояниях:
- терминальная стадия почечной недостаточности и гемодиализ;
- гемоглобинопатии;
- лечение эритропоэтином;
- гемолитическая анемия;
- возраст, раса/этническая принадлежность;
- острая кровопотеря;
- беременность;
- любое состояние/лечение, которое влияет на продолжительность жизни эритроцитов.
/9_u3.jpg)
3. Гликированный альбумин
Альбумин является высокомолекулярным белком с м.в. 66,7 кДа, состоящим из одной полипептидной цепи, которая содержит 585 аминокислот, 17 дисульфидных мостиков и 3 гомологичных домена, связанных в спиральную структуру [28]. Это основной белок плазмы, который составляет около 60 % от общего белка крови с концентрацией от 35 до 50 г/л и периодом полураспада от 14 до 20 дней [29]. Структура альбумина способствует выполнению его физиологических функций, таких как поддержание рН и осмотического давления. Кроме того, альбумин действует как мощный антиоксидант и как основной транспортер продуктов метаболизма, ионов, питательных веществ, гормонов и жирных кислот [30]. Подобно другим белкам, альбумин принимает участие в физиологическом процессе гликирования [31]. Гликирование (реакция Mailard) является неферментативной спонтанной реакцией, в которой глюкоза связывается со свободной аминогруппой (обычно лизин или аргинин), присутствующей в белке. Первый шаг этой реакции включает образование нестабильного и обратимого продукта, известного как основание Шиффа, между карбонильной группой ациклического углевода и N-концом аминокислоты. Этот промежуточный продукт подвергается конформационным изменениям и приводит к стабильному и необратимому продукту, известному как продукт Амадори, который представляет собой фруктозолизин, т.е. реакцию между глюкозой и лизином, встречающуюся на 59 сайтах лизина в альбумине. Лизин-525 был идентифицирован как самый большой сайт гликирования альбумина, что подтверждается в экспериментах in vivo и in vitro [32, 33] (рис. 4).
Кетоамины, образованные неферментативным гликозилированием, имеют химическое название «фруктозамин». Среди фруктозаминов сыворотки гликированный альбумин (ГА) является основным компонентом и составляет около 80 % от общих гликозилированных белков плазмы. Концентрация глюкозы и время экспозиции между белком и глюкозой считаются определяющими факторами гликирования, которое происходит в течение жизни белка, то есть гликирование зависит от степени и длительности гипергликемии. Внеклеточный белок, каким является альбумин, более восприимчив к перестройке Амадори, чем внутриклеточный белок гемоглобин. Это объясняет различия в скорости гликирования альбумина, которая в 9–10 раз больше, чем у гемоглобина. В экспериментах было доказано, что синтез ГА был примерно в 4,5 раза больше, чем HbA1c, после добавления известных концентраций глюкозы в образцы здоровых добровольцев. Эти данные показывают, что даже при одинаковом гликировании в условиях in vitro гликированный альбумин синтезируется быстрее, чем HbA1c.
Гликированный альбумин для мониторинга глюкозы
В отличие от долгосрочного образования HbA1с (средняя продолжительность жизни эритроцитов — около 120 дней), ГA образуется в течение примерно 2–4 недель (рис. 5).
Это повышает чувствительность гликированного альбумина к быстрым изменениям уровня глюкозы. Поэтому измерение ГА больше подходит для мониторинга начала медикаментозной терапии при СД, а также для контроля дозирования или замены лекарственного препарата, так как его уровни изменяются быстрее, чем HbA1c, при интенсивном лечении.
Лабораторный метод измерения гликированного альбумина
Исторически фруктозамин использовался в клинической практике, когда была необходимость в краткосрочной оценке гликемии [34]. Тем не менее этот тест имеет низкую точность, так как на его определение влияют многие молекулы, присутствующие в крови, такие как билирубин, мочевая кислота и низкомолекулярные вещества. Не существует также международных стандартов его применения.
Методы оценки ГА были разработаны с 1980-х годов с использованием сыворотки или плазмы крови. Эти методы имели многочисленные недостатки из-за сложности выполнения, высокой стоимости и/или отсутствия точности. Отсутствие стандартизации этого теста привело к непопулярности гликированного альбумина, и все внимание было направлено на HbA1c [35]. ГА может быть измерен с помощью ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии, боронат-аффинной хроматографии, иммуноанализа, колориметрического метода с т иобарбитуровой кислотой и ферментативными методами с использованием протеиназы и кетаминоксидазы [36]. Однако эти методы недоступны в рутинной лабораторной практике.
Новый набор Lucica® Glycated Albumin-L (Asahi-Kasei Pharma Corporation, Япония) представляет собой ферментативный метод для определения ГА с коротким периодом исследования и упрощенной процедурой. Может выполняться как вручную, так и на автоматических биохимических анализаторах. Метод определения ГА включает 3 этапа (рис. 6).
На первом этапе гликированные аминокислоты высвобождаются из гликированного альбумина посредством действия альбумин-специфичной протеазы. Кетоаминоксидаза расщепляет ГА на свободные аминокислоты и глюкозон, который является промежуточным продуктом реакции Амадори. Окрашивание прямо пропорционально количеству ГA в образце. На втором этапе альбумин плазмы реагирует с бромкрезоловым зеленым в кислой среде, в результате чего образуется окрашенное соединение, которое напрямую связано с общей концентрацией альбумина. Третий этап состоит в математическом расчете с определением процента ГA с учетом двух предыдущих реакций.
/10_u.jpg)
Референтные значения гликированного альбумина
В 2006 году Японское диабетическое общество (JDS) установило референтный интервал для ГA от 12,3 до 16,9 % [37]. Несколько лет спустя в более крупном исследовании (N = 1575) опубликован референтный интервал для ГA от 12,2 до 16,5 %. Кроме того, это исследование показало, что cut-off для GA ≥ 15,5 % имеет хорошую чувствительность и специфичность для выявления СД с использованием глюкозы натощак и HbA1c (≥ 7,0 ммоль/л и ≥ 6,5 % соответственно) в качестве контрольных тестов [38].
Ограничения при использовании ГА
В некоторых случаях нарушение метаболизма альбумина может влиять на значение ГА. Не рекомендуется использовать ГА как маркер при гипертиреозе, гипотиреозе, циррозе печени, нефротическом синдроме с массивной протеинурией. Концентрация ГА зависит от возраста, ИМТ, наличия воспаления (повышенный С-реактивный белок), гипертриглицеридемии, курения. Поэтому при интерпретации уровней ГА необходимо быть осторожными в некоторых клинических ситуациях.
Заключение
Лабораторные исследования для определения HbA1c и гликированных белков необходимы в первую очередь для того, чтобы осуществлять мониторинг уровня глюкозы крови больных СД. Хотя анализ на гликированный гемоглобин является более распространенным, в ряде случаев, когда его проведение затруднено, может успешно использоваться анализ на гликированные белки. Особенно это важно для пациентов, находящихся на гемодиализе. Во многих исследованиях было показано, что определение гликированного альбумина имеет хорошую диагностическую точность и тесно связано с диабетическими микрососудистыми осложнениями. Несмотря на все свои преимущества ГА не заменяет использование HbA1c, так как и тот и другой тест имеют свои преимущества и недостатки.
Список литературы
Список литературы находится в редакции