Журнал "Гастроэнтерология" 1 (47) 2013

В останні роки лікування хронічних захворювань шлунка, асоційованих із Helicobacter pylori (НР), у дітей стає досить складним завданням у зв’язку зі швидким розвитком та неухильним зростанням антибіотикорезистентності НР, високим рівнем реінфікування [1–4]. Встановлено, що наявність у геномі НР CagA-гену пов’язана з більш агресивним перебігом захворювання та зменшенням ефективності ерадикації [5–9]. Це вимагає пошуку нових лікарських форм, режимів лікування та створення дійових альтернативних лікувальних схем [10–12]. Набуває багатьох прихильників концепція про доцільність використання у комплексному лікуванні НР-асоційованих хронічних гастритів (ХГ) препаратів, що змінюють імунну реактивність, підвищують колонізаційну резистентність слизової оболонки шлунка (СОШ) [13, 14]. Розуміння впливу активних метаболітів вітаміну D на функціонування неспецифічних механізмів локального мукозального захисту та специфічного імунітету надає можливість застосувати холекальциферол як ад’ювантну терапію НР-асоційованих гастритів у дітей [15–17].

Мета дослідження. Дослідити динаміку змін імуноморфологічних характеристик СОШ при хронічних Нр-асоційованих гастритах у дітей з урахуванням CagA-статусу до та після проведення стандартної та модифікованої холекальциферолом ерадикаційної терапії.

Матеріали та методи дослідження

Під спостереженням перебували 79 дітей віком від 8 до 17 років, хворих на хронічний Нр-асоційований гастрит, які лікувалися у гастроентерологічному відділенні КЗ «МДКЛ № 1» м. Дніпропетровська протягом 2009–2011 рр. Усім пацієнтам була проведена фіброезофагогастродуоденоскопія (ФЕГДС) (Pentax FG15W, Японія) з біопсією СОШ та гістологічною оцінкою біоптатів згідно з вимогами морфологічного розділу сучасної Сіднейсько-Х’юстонської системи, доповнень Міжнародної класифікації гастриту та візуально-аналогової шкали (ВАШ) з еталонами напівкількісної оцінки морфологічних змін [18, 19].

Визначення НР-асоційованості здійснювалось за результатами швидкого уреазного тесту (Хелпіл-тест, ООО «АМА», Росія, м. Санкт-Петербург) та як «подвійний контроль», в імуногістохімічному (ІГХ) дослідженні. Оцінку CagA-статусу проводили шляхом визначення сумарних антитіл до CagA-антигену НР у сироватці крові.

За характером антихелікобактерної терапії усі пацієнти були поділені на дві групи: 1-ша група — 39 пацієнтів, які отримували стандартну терапію за протоколом; 2-га група — 40 пацієнтів, які додатково до стандартної схеми отримували 1000 МО холекальциферолу щоденно протягом 2 тижнів.

Для контролю ефективності лікування та визначення подальшої персистенції НР-інфекції через 4–6 тижнів проводили контрольну ФЕГДС зі швидким уреазним тестом, морфологічним та ІГХ-дослідженням контрольних біоптатів.

Для морфологічного дослідження біоптати СОШ фіксували у 4% розчині нейтрального формаліну протягом доби і заливали в парафін. Гістологічні зрізи товщиною 4–6 мкм наносили на адгезивні предметні скельця SuperFrost Plus, після депарафінізації та регідратації зрізів для ІГХ проводили температурне демаскування антигенів (зрізи були розміщені в цитратному буфері з рН 6.0 і підігрівалися в автоклаві при температурі +121 єС упродовж 8 хвилин) та пригнічували активність ендогенної пероксидази 3% розчином перекису водню протягом 20 хвилин. Далі проводили інкубацію зрізів з первинними антитілами у вологих камерах при температурі 23–25 єС протягом 30 хвилин. Як первинні використовували моноклональні антитіла до CD3, CD20, CD68, S100, Кі-67 (LabVision) та поліклональні до НР (LabVision, Helicobacter pylori Rabbit Polyclonal Antibody). Титр антитіл добирали індивідуально для кожного маркера з використанням спеціального розчину Antibody Dіluent (DakoCytomation). Візуалізацію проводили за системою UltraVision Quanto (LabVision), ідентифікацію реакцій — за допомогою хромогену DAB (LabVision) під контролем мікроскопу від 20 секунд до 3 хвилин. Для диференціювання структур тканин зрізи додатково забарвлювали гематоксиліном Майєра і вивчали світловою мікроскопією з використанням мікроскопа Leika DLM-E (США) з використанням об’єктивів х10, х20, х40, х100.

Згідно з критеріями модифікованої Сіднейсько-Х’юстонської системи, ступені лімфоплазмоцитарної клітинної інфільтрації, поліморфноядерної клітинної інфільтрації, атрофії залоз та кишкової метаплазії СОШ були класифіковані за ВАШ: 0 — нормальний, 1 — слабкий, 2 — помірний та 3 — значний. Про стан слизової оболонки щодо атрофії судили за відносною товщиною епітеліальної пластинки, кількістю, величиною та глибиною розташування шлункових залоз. Щільність заселення НР у СОШ оцінювали за напівкількісною шкалою, виділяючи негативний (0), слабкий (1), помірний (2) та високий (3) ступені [20, 21].

Представництво CD3⁺ Т-лімфоцитів, CD20⁺ В-лімфоцитів, CD68⁺-макрофагів та S100⁺ дендритних клітин у СОШ вивчали в 10 полях зору і обчислювали як середнє арифметичне абсолютних значень, відмічали загальну кількість імуноцитів, їх локалізацію, окремо відзначали відсоток інтраепітеліального розташування з розрахунком на 1000 ядер та аналізували ступінь забарвлення. Індекс проліферації (ІП) обчислювали, як відношення абсолютної кількості забарвлених ядер на 1000 епітеліальних клітин, на підставі вивчення інтрануклеарної експресії маркера Кі-67. Внутрішнім контролем були поодинокі інтрануклеарні реакції строми або запального інфільтрату.

Визначення hBD2 в шлунковому вмісті проводили за методикою вестерн-блоту. Для виділення hBD2 зі зразків шлункового соку використовували метод зворотнофазової хроматографії із застосуванням як рухливої фази ацетонітрилу (CH₃CN), підкисленого 0,05% трифтороцтовою кислотою до pH 2,5. Отримані фракції збирали, ліофільно висушували та розчиняли в мінімальному об’ємі деіонізованої води (50 мкл) із подальшим проведенням електрофорезу отриманих зразків у поліакриламідному гелі з підготуванням проб за Лемлі. Після електрофоретичного розділення та відмивання проводили електроперенос білків на нітроцелюлозну мембрану протягом 18 год при напруженості поля 60 В. Для блокування сайтів неспецифічного зв’язування антитіл нітроцелюлозну мембрану інкубували з розчином 1 % ембріональної сироватки протягом 1 години, після чого відмивали PBS-T-буфером та інкубували з моноклональними антитілами (Інститут онкології АМН, м. Київ, Україна), специфічними до бета-дефензину-2 людини протягом 2,5 год [22]. Для візуалізації за допомогою реакції фотолюмінесценції в системі ICL додавали антитіла (кон’югат), мічені пероксидазою хрону, та інкубували протягом 1 год. Для проявлення нітроцелюлози використовували концентрат ECL. Проявляли блот, використовуючи рентгенівську плівку та стандартні реактиви для проявлення рентгенівських плівок (ОНІКО, м. Київ, Україна).

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програм SPSS Statistica 17.0, Statgraf, Matstat. Для встановлення статистично значущих відмінностей між показниками в групах за різних умов лікування використовували точний тест Фішера, між експресією маркерів та морфологічними характеристиками — непараметричний U-критерій Манна — Уїтні. Виявлення й оцінку характеру зв’язку між показниками проводили за допомогою рангової кореляції з розрахунком непараметричного коефіцієнта кореляції Спірмена (r). Значущим вважався зв’язок при р < 0,05 [23].

Результати та обговорення

При контрольному обстеженні дітей 1-ї групи, які отримували терапію за протоколом, за даними уреазного тесту у 26 пацієнтів (66,7 %) встановлено ефективну ерадикацію НР, у 13 (33,3 %) лікування визначено невдалим. У 2-й групі, пацієнти якої додатково отримували холекальциферол, відсоток вдалої ерадикації виявився значно вищим — 82,5 % (р = 0,037). Встановлено прямий помірний кореляційний зв’язок між підвищенням ефективності лікування (збільшенням кількості негативних уреазних тестів) із модифікацією схеми лікування за рахунок включення холекальциферолу (r = +0,328). Слід відзначити, що більшість дітей із персистенцією НР після лікування страждали від CagA-позитивного НР-асоційованого ХГ. У групі, пацієнти якої лікувалися за протоколом, частка CagA-позитивних пацієнтів із невдалою ерадикацією становила 28,2 % (11 спостережень із 39), тоді як у 2-й групі цей показник був лише 15,0 % (6 спостережень із 40) (табл. 1).

Дослідження контрольних біоптатів СОШ пацієнтів 1-ї групи продемонструвало значне зменшення щільності контамінації СОШ НР після лікування (p = 0,015) (табл. 2).

У 8 пацієнтів із персистенцією НР щільність заселення СОШ після лікування також зменшилась порівняно з показниками до лікування (рис. 1А), зберігаючись переважно на слабкому рівні (рис. 1В), aле у 5 пацієнтів, хворих на CagA-позитивний НР-асоційований ХГ, стійких до проведеної терапії, показник інтенсивності колонізації лишився майже незмінним, сягаючи середнього рівня.

Стандартне морфологічне дослідження біоптатів СОШ пацієнтів 1-ї групи визначило зменшення активності запалення порівняно з початковими показниками (табл. 2). Серед 26 пацієнтів із вдалою ерадикацією НР у 18 спостерігалися ознаки неактивного поверхневого гастриту, у 8 — ХГ з мінімальною активністю (на рівні 1 бала за ВАШ). Такі показники, як атрофія шлункових залоз, кишкова метаплазія, за нашими даними, не зазнали суттєвих змін після лікування (р = 0,081, р = 0,063 відповідно). Ймовірно, виникнення цих морфологічних змін пов’язане не лише з інфікуванням НР, але й з іншими складними механізмами альтерації СОШ, що вимагають додаткового дослідження.

Склад лімфоплазмоцитарного інфільтрату після лікування в кожному окремому спостереженні був досить різнорідним, що знайшло відображення в різній кількості балів за ВАШ (табл. 2), але загальна кількість мононуклеарів після лікування порівняно з даними біопсій до лікування значно зменшилась (p < 0,001). Особливо звертає на себе увагу зменшення кількості В-лімфоцитів, які до лікування часто утворювали фолікули (2–3-й ступінь за ВАШ), а після лікування вже розташовувались у вигляді поодиноких інтраепітеліальних CD20-позитивних клітин у межах норми або на рівні 1 за ВАШ (рис. 2). Цікаво, що у 5 з 13 випадків із персистенцією НР продовжувала спостерігатися помірна інфільтрація CD20-клітинами, до того ж усі ці пацієнти виявилися CagA-позитивними).

Морфологічне дослідження контрольних біоптатів СОШ пацієнтів 2-ї групи, які лікувалися за схемою з холекальциферолом, продемонструвало більш значне зниження показників щільності колонізації НР (р₁ < 0,001), кількості поліморфноядерних лейкоцитів (р₁ < 0,001) після лікування (табл. 3). Інші морфологічні характеристики — кишкова метаплазія, атрофія залоз, як і у 1-й групі, значущих змін не зазнали (р₁ = 0,057, р₁ = 0,142 відповідно). Ступінь атрофії та кишкової метаплазії СОШ був значно вищий у CagA-позитивних пацієнтів: у 4 із 6 хворих на CagA-позитивний НР-асоційований ХГ із персистенцією НР після ерадикації цей показник був на 2-му рівні за ВАШ.

ІГХ-дослідження біоптатів СОШ пацієнтів 2-ї групи визначило зменшення CD3⁺ Т-лімфоцитарної (р₁ < 0,001) і СD20⁺ В-лімфоцитарної (р₁ < 0,001) інфільтрації, а також зниження кількості CD68⁺-макрофагів (р₁ < 0,001) порівняно з аналогічними показниками до лікування (рис. 3, 4) та показниками 1-ї групи після лікування (р₂ = 0,012, р₂ = 0,030, р₂ = 0,034 відповідно). Кількість дендритних клітин не зазнала значущих змін у динаміці спостереження.

Дослідження показників проліферативної активності на підставі визначення імуногістохімічного маркера Кі-67 (із розрахунком ІП) у біоптатах СОШ хворих на хронічний НР-асоційований гастрит до та після лікування за двома різними схемами продемонструвало наявність статистично значущої різниці між групами за точним критерієм Фішера з перевагою схеми лікування, модифікованої холекальциферолом (р = 0,033) (табл. 4).

Також був виявлений помірний зворотний кореляційний зв’язок між зниженням проліферативної активності епітеліоцитів СОШ та підвищенням ефективності лікування за рахунок модифікації терапії холекальциферолом (r = –0,415). ІП епітелію шлункових залоз у випадках персистенції НР після лікування також був значно вищим, ніж у середньому після ерадикації (рис. 5).

При визначенні hBD2 у шлунковому вмісті дітей досліджуваних груп з’ясувалось, що CagA-позитивні пацієнти характеризуються значно вищими рівнями hBD2 порівняно з CagA-негативними (р > 0,05). Так, медіана концентрації hBD2 до лікування у дітей, хворих на CagA-позитивний ХГ, становила (0,394 ± 0,089) мкг/мл, тоді як у CagA-негативних хворих — (0,249 ± 0,064) мкг/мл. У пацієнтів 2-ї групи, які отримували терапію з холекальциферолом, встановлено наявність прямого позитивного кореляційного зв’язку рівня hBD2 зі ступенем інфільтрації СОШ CD68⁺-макрофагами (r = 0,474), S100⁺ дендритними клітинами (r = 0,333), СD20⁺ В-лімфоцитами (r = 0,290) до лікування, а також зворотного кореляційного зв’язку рівня hBD2 з успішністю ерадикації (r = –0,295). hBD2 не визначався у шлунковому вмісті після лікування в жодному випадку вдалої ерадикації.

Таким чином, схема ерадикації з застосуванням холекальциферолу виявила вірогідно більшу ефективність, ніж звичайна схема, що знайшло підтвердження в збільшенні відсотка вдалої ерадикації (р = 0,042) та щільності заселення СОШ НР (р < 0,001) Позитивні ефекти модифікованого лікування пов’язані зі зменшенням кількості поліморфноядерних лейкоцитів (р₂ = 0,011), CD3⁺ Т-лімфоцитів (р₂ = 0,012), CD20⁺-В-лімфоцитів (р₂ = 0,030), CD68⁺-макрофагів (р₂ = 0,034), а також зі зменшенням ІП (р = 0,033), що є свідченням потужного протизапального, імуномодулюючого та антипроліферативного впливу холекальциферолу. Рівень hBD2 у шлунковому вмісті корелює зі ступенем мононуклеарної інфільтрації СОШ і може бути маркером персистенції запалення у випадках невдалої ерадикації НР.

Висновки

1. Включення холекальциферолу до схеми лікування хронічних НР-асоційованих гастритів у дітей дозволяє підвищити ефективність терапії за рахунок збільшення відсотка ефективної ерадикації.

2. Основою позитивних ефектів модифікованого холекальциферолом лікування є посилення безпосереднього антибактеріального, протизапального та антипроліферативного впливу за рахунок значущого зменшення щільності заселення СОШ НР, кількості поліморфноядерних лейкоцитів, CD3⁺ Т-лімфоцитів, CD20⁺ В-лімфоцитів, CD68⁺-макрофагів та ІП.

3. Визначення hBD2 у шлунковому вмісті після лікування може бути маркером неефективності ерадикації та персистенції запалення.