Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.



UkrainePediatricGlobal

UkrainePediatricGlobal

Журнал "Здоров`я дитини" 3(18) 2009

Повернутися до номеру

Антиэндотоксиновый иммунитет у детей с перитонитом с учетом тинкториальных свойств возбудителя на этапе госпитализации

Автори: Кривченя Д.Ю., Мальцев В.Н., Ковалев В.А., Притуло Л.Ф. Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, г. Симферополь

Рубрики: Педіатрія/Неонатологія

Версія для друку


Резюме

Для изучения антиэндотоксинового иммунитета при перитоните проведено исследование у 114 детей. Перитонит приводит к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется в угнетении специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭT-IgG) и активации неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14) с наибольшей степенью выраженности для разлитой формы перитонита. Установленная зависимость тяжести перитонита от степени дисрегуляции антиэндотоксинового иммунитета наиболее характерна для грамотрицательной флоры, при которой наблюдается резкое снижение анти-ЭT-IgG и повышение анти-ЭT-IgM, анти-ЭT-IgF, LBP и sCD14 в сравнении с грамположительной и смешанной инфекцией.


Ключові слова

перитонит у детей, антиэндотоксиновый иммунитет.

Распространенность перитонита в детском возрасте составляет в настоящее время от 1 до 2,5 % среди всех случаев «острого живота», требующих хирургического вмешательства [1, 2].
Значительное количество осложнений и летальных исходов при перитоните возникает как следствие многообразных патогенетических механизмов, задействованных при данном заболевании, многие из которых на сегодняшний день изучены недостаточно [1]. Представления о ведущих механизмах перитонита с течением времени претерпели определенную трансформацию [2]. В настоящее время проблема перитонита все больше рассматривается как проблема воспаления [3].
В наших предыдущих работах было показано, что при перитоните у детей наблюдается гиперсекреция провоспалительных медиаторов в брюшной полости, что связано с дисбалансом в системе цитокиновой регуляции Т-хелперов 1-го, 2-го типов, который проявляется гиперсекрецией цитокинов клеточного профиля (ИЛ-2, ИФ-g) и снижением гуморального (ИЛ-4, ИЛ-10). Грамотрицательная инфекция по сравнению с грамположительной и смешанной при перитоните ассоциируется с более выраженной секрецией провоспалительных медиаторов, которая связана с преобладанием цитокинов клеточного профиля.
Считается, что именно эндотоксин (ЭТ) грамотрицательных инфекций играет одну из ведущих ролей в формировании синдрома эндогенной интоксикации. Он обладает исключительно высокой биологической активностью и относится к числу наиболее сильных экзогенных модуляторов иммунологической реактивности. Основное патофизиологическое действие ЭТ опосредуется индукцией выброса целого ряда эндогенных медиаторов воспаления, синтезируемых в основном клетками миеломоноцитарного ряда [4].
Эндотоксин связывается с плазменным белком (Lipopolysaccharide Binding Protein — LBP), который обладает высоким аффинитетом к липиду А и опосредует взаимодействие эндотоксина с мембраносвязывающими рецепторами CD14 и TLR4 (toll-like receptor 4) на клетках моноцитарно-макрофагального ряда, потенцирует выработку этими клетками провоспалительных цитокинов [5, 6]. LBP имеет массу 60 kDa и связывает липиды/фосфолипиды, а также протеины с довольно широкой специфичностью. Его первичная роль по отношению к эндотоксину заключается в связывании последнего от бактериальной мембраны или от скопления циркулирующего эндотоксина, с последующим взаимодействием с CD14, которое приводит к целевой клеточной активации [7, 8].
К гуморальным, неспецифическим механизмам индукции антиэндотоксинового иммунитета можно отнести LBP и sCD14, а деактивация эндотоксина осуществляется естественными антиэндотоксиновыми антителами.
В связи с этим целью данной работы стало изучение показателей специфического и неспецифического антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами перитонита с учетом тинкториальных свойств возбудителя на этапе госпитализации.

Материалы и методы
Для изучения антиэндотоксинового иммунитета при перитоните проведено исследование у 114 детей, госпитализированных в хирургическое отделение Республиканской детской клинической больницы г. Симферополя.
Согласно классификации В.К. Гостищева (1992) у больных имел место местный перитонит — 70 (61,4 %) случаев, диффузный — 28 (24,56 %) и разлитой — 16 детей (14,03 %). Возраст больных колебался от 1 года до 14 лет.
В зависимости от тинкториальных свойств возбудителя пациенты были разделены на 3 субгруппы: с грамотрицательной, грамположительной и смешанной флорой.
Контрольную группу составили 110 условно здоровых детей того же возраста.
Количество мальчиков, девочек и возраст в исследуемых группах статистически не отличались.
Уровни антиэндотоксиновых антител классов А, М, G (соответственно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [9, 10]. В качестве антигена использовали липополисахарид грамотрицательной энтеробактерии Escherichiacoli K30 (O9:K30:H12), выделенный из бактериальной биомассы методом водно-фенольной экстракции и дополнительно очищенный от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия). Уровни анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки крови 1 : 50 (для анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM) и 1 : 200 (для анти-ЭТ-IgG).
Для исследования LBP и sCD14 использовали тест-системы «Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HK315» и «Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number:
HK320» производства Hycult biotechnology (Голландия). Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационных микропланшетах, покрытых антителами к LBP или sCD14. Во время инкубации LBP или sCD14 связывались с антителами, несвязанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к LBP или sCD14 добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептавидин-пероксидазный конъюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе StatFox 2100 на длине волны 450 нм [11]. Содержание LBP и sCD14 выражали в мкг/мл.
Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный номер MS0011) ДНПП ООО «Альфа», г. Донецк.
При анализе для проверки распределения на нормальность использовали Хи-квадрат и критерий W Шапиро — Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок проводили с использованием W-критерия Вилкоксона, сравнение средних двух независимых выборок — по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения использовали ранговый однофакторный анализ Крускала — Уоллиса и критерий Данна [12].

Результаты и их обсуждение
Вначале статистическому анализу были подвергнуты показатели антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами перитонита на 1-е сутки госпитализации (табл. 1).
При анализе данных табл. 1 было выявлено, что уровень анти-ЭТ-IgG был достоверно снижен (Р < 0,01) при всех формах перитонита по сравнению с показателями контрольной группы. При множественном анализе форм перитонита было выявлено, что самые низкие значения анти-ЭТ-IgG зафиксированы для разлитой формы по сравнению с диффузной и местной (Р < 0,01). В свою очередь, уровни анти-ЭТ-IgМ и анти-ЭТ-IgА были достоверно выше контроля (Р < 0,01) при всех формах перитонита, при этом при разлитой и диффузной формах увеличение концентрации анти-ЭТ-IgА было достоверно выше (Р < 0,01), чем при местной.
Показатели неспецифического антиэндотоксинового иммунитета (LBP и sCD14) были статистически значимо повышены (Р < 0,01) при всех формах перитонита. Для показателя sCD14 было установлено, что его повышение при разлитой и диффузной формах было достоверно выше (Р < 0,01), чем при местной.


Таким образом, анализ табл. 1 свидетельствует о том, что перитонит у детей приводит к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется в угнетении специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭТ-IgG) и активации неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14). Данные изменения наиболее характерны для разлитой формы перитонита.
На данном этапе работы мы раскрыли основные механизмы иммунного ответа на эндотоксин в зависимости от формы (тяжести) перитонита, что позволило нам перейти к анализу полученных результатов в зависимости от типа возбудителя в контексте изучаемой проблемы (табл. 2).


Данные, представленные в табл. 2, характеризуют показатели антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами перитонита на 1-е сутки госпитализации в зависимости от типа возбудителя. Их анализ позволил установить, что для анти-ЭТ-IgG характерно снижение концентрации в грамотрицательной субгруппе разлитой формы, грамотрицательной и смешанной субгруппах диффузной формы и грамотрицательной субгруппе местной формы (Р < 0,01). Кроме того, во всех формах грамотрицательных субгрупп уровень анти-ЭТ-IgG был достоверно ниже, чем в остальных субгруппах в пределах каждой формы (Р < 0,01).
Межсубгрупповой анализ для анти-ЭТ-IgG (табл. 2) позволил установить различие между грамотрицательными субгруппами разлитой и местной форм (Р < 0,01), а также разлитой и диффузной (Р < 0,01). Самые низкие значения анти-ЭТ-IgG были зафиксированы для разлитой формы грамотрицательной субгруппы.
Установление отличия показателей анти-ЭТ-IgM (табл. 2) опытных субгрупп от контроля позволило выявить следующие закономерности: повышение содержания анти-ЭТ-IgM в субгруппах с грамотрицательной флорой при всех формах и в субгруппе со смешанной флорой при диффузной форме (Р < 0,01). При этом в грамотрицательных субгруппах разлитой и местной форм было достоверное (Р < 0,01) повышение уровня анти-ЭТ-IgM по сравнению с другими субгруппами.
Межсубгрупповой анализ для анти-ЭТ-IgM достоверных отличий не выявил (Р>0,05).
Уровень анти-ЭТ-IgA (табл. 2) был достоверно выше контроля во всех субгруппах (Р < 0,01) за исключением грамположительной при местной форме. При местной форме грамотрицательной субгруппы уровень анти-ЭТ-IgA был достоверно выше, чем в других субгруппах той же формы (Р < 0,01).
Межсубгрупповой анализ показал отличие концентрации анти-ЭТ-IgA на уровне значимости Р < 0,01 для соответствующих субгрупп диффузной и местной форм, а также отличие между всеми субгруппами разлитой и местной форм.
Для LBP (табл. 2) было установлено достоверное повышение по сравнению с контролем в обеих субгруппах разлитой формы (Р < 0,01), грамотрицательной (Р < 0,01), грамположительной (Р < 0,05) и смешанной (Р < 0,05) субгруппах диффузной формы и грамотрицательной субгруппе местной формы (Р < 0,01). При местной форме грамотрицательной субгруппы значение LBP было достоверно выше (Р < 0,01), чем в других субгруппах этой формы. Грамотрицательные, грамположительные и смешанные субгруппы диффузной и местной форм различались с достоверностью соответственно Р < 0,05, Р < 0,01 и Р < 0,01. Субгруппы разлитой и местной форм различались на уровне значимости Р < 0,01.
При анализе последнего показателя, sCD14 (табл. 2), было выявлено, что во всех субгруппах, за исключением грамположительной и смешанной при местной форме, произошло его повышение с достоверностью Р < 0,01. Для всех форм перитонита характерно то, что максимальное повышение этого показателя установлено в грамотрицательных субгруппах, а минимальное — в грамположительных, причем показатели всех субгрупп в пределах соответствующей формы отличались на уровне значимости Р < 0,01.
Межсубгрупповой анализ для sCD14 позволил установить, что субгруппы разлитой формы отличаются от соответствующих субгрупп диффузной и местной форм на уровне Р < 0,01. Кроме того, грамположительная и смешанная субгруппы диффузной формы отличаются от соответствующих субгрупп местной формы также на уровне Р < 0,01.
Обобщая результаты, приведенные в табл. 2, можно прийти к заключению, что при грамотрицательной инфекции у детей с перитонитом наблюдаются резкое снижение анти-ЭТ-IgG и повышение анти-ЭТ-IgМ, анти-ЭТ-IgА, LBP и sCD14 по сравнению с грамположительной и смешанной инфекцией. Следует заметить, что установленная нами зависимость тяжести перитонита от степени дисрегуляции антиэндотоксинового иммунитета наиболее характерна для грамотрицательной флоры.
Несомненно, полученные результаты, которые согласуются с литературными данными [4, 8], раскрывают совершенно новые патогенетические связи антиэндотоксинового иммунитета, с одной стороны, с тяжестью течения, с другой — в анализе с различными типами возбудителя.

Выводы
1. Перитонит у детей приводит к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется в угнетении специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭТ-IgG) и активации неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14) с наибольшей степенью выраженности для разлитой формы перитонита.
2. Установленная зависимость тяжести перитонита от степени дисрегуляции антиэндотоксинового иммунитета наиболее характерна для грамотрицательной флоры, при которой наблюдается резкое снижение уровня анти-ЭТ-IgG и повышение анти-ЭТ-IgМ, анти-ЭТ-IgА, LBP и sCD14 по сравнению с грамположительной и смешанной инфекцией.
Перспективы дальнейших исследований. С учетом полученных данных о роли антиэндотоксинового иммунитета у больных с перитонитом планируется изучение иммунокоррекции у данной категории в зависимости от стадийности септического процесса и патогенетических механизмов ответа организма на эндотоксин грам­отрицательной флоры.


Список літератури

1. Баиров Г.А. Срочная хирургия детей: Руководство для врачей. — СПб., 1997. — 462 с.
2. Федоров К.К. Первичный перитонит у детей // Бюллетень сибирской медицины. — 2004. — № 2. — С. 47-56.
3. Пастернак І.І., Боднар Б.М., Безруков Л.О., Бро­жик В.Л., Боднар О.Б., Шестобуз С.В. Сучасна оцінка імунологічних показників у дітей з гострим деструктивним апендицитом, ускладненим поширеними формами перитоніту // Буковинський медичний вісник. — 2000. — Т. 4, № 1–2. — С. 85-87.
4. Bierhaus A., Chen J., Liliensiek B., Nawroth P.P. LPS and cytokine-activated endothelium // Semin. Thromb. Hemost. — 2000. — Vol. 26, № 5. — P. 571-587.
5. Chen G., Li J., Ochani M., Rendon-Mitchell B., Qiang X. et al. Bacterial endotoxin stimulates macrophages to release HMGB1 partly through CD14- and TNF-dependent mechanisms // J. Leukoc. Biol. — 2004. — Vol. 76, № 5. — P. 994-1001.
6. Gioannini T.L., Teghanemt A., Zarember K.A., Weiss J.P. Regulation of interactions of endotoxin with host cells // J. Endotoxin Res. — 2003. — Vol. 9, № 6. — P. 401-408.
7. Van Bossuyt H., De Zanger R.B., Wisse E. Cellular and subcellular distribution of injected lipopolysaccharide in rat liver and its inactivation by bile salts // J. Hepatol. — 1988. — Vol. 7. — P. 325-337.
8. Weiss J. Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) and lipopolysaccharide-binding protein (LBP): structure, function and regulation in host defence against Gram-negative bacteria // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — Vol. 31(Pt. 4). — P. 785-90.
9. Гордієнко А.І., Білоглазов В.О. Патент 70193 А Україна, МКІ 7 А61К31/01. Спосіб визначення антитіл до діполісахаридів грамнегативних бактерій; Заявл. 29.12.2003; Опубл. 15.09.2004, Бюл. № 9.
10. Гордиенко Ан.И., Белоглазов В.А., Гордиенко Ал.И. Микротурбидиметрический метод определения IgG, IgM, IgA человека // Iмунологiя та алергологiя. — 2000. — № 1. — С. 12-15.
11. Tiirola T., Jaakkola A., Bloigu A., Paldanius M., Sinisalo J., Nieminen M.S., Silvennoinen-Kassinen S., Saikku P., Jauhiainen M., Leinonen M. Novel enzyme immunoassay utilizing lipopolysaccharide-binding protein as a capture molecule for the measurement of chlamydial lipopolysaccharide in serum // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. — 2006. — Vol. 54(1). — P. 7-12.
12. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях. — К.: Морион, 2000. — 319 с. 


Повернутися до номеру