Международный эндокринологический журнал 4(16) 2008

Наполнение современного фармацевтического рынка происходит главным образом не за счет инновационных препаратов (оригинальных лекарственных средств (ЛС), брэндов) срок патентной защиты которых закончился и они перестали быть собственностью компании-разработчика, а за счет воспроизведенных форм (генериков). В 1995 г. их доля в общем мировом производстве составляла 65 %, в то время как в 1991 г. — 40 %, а в 1975 г. — всего 9 % [1]. Распространенность генериков на национальных рынках неоднородна: объем продаж воспроизведенных ЛС в 2003 г. в США — 25 %, Германии — 35 %, Великобритании и Венгрии — 55 %, Польше — 61 %, Словакии — 66 %, России — 78 % [2]. Преобладают генерики зарубежного и отечественного производства и в Украине. Например, из 117 препаратов диклофенака натрия всего 4 — оригинальные формы, нифедипин представлен 3 брэндами и 21 генерической копией, амиодарон — 2 брэндами и 11 копиями, клопидогрель — 1 брэндом и 4 копиями, метопролол — только в виде 8 копий [3, 4]. Главное преимущество генериков — более низкая по сравнению с оригинальными ЛС стоимость, а недостаток — качественная неоднородность, что, несмотря на невысокую цену, при низкой эффективности и неподтвержденной безопасности ведет к значительным дополнительным затратам из-за побочных реакций и осложнений. Так, частота проявления нежелательных эффектов у отдельных препаратов, содержащих в качестве активного фармацевтического ингредиента (АФИ) диклофенак натрия, — около 16,9 %, в то время как для Вольтарена^® она значительно ниже — около 3,7 % [5]. В связи с этим возникают проблемы обоснованной фармацевтической замены и выбора критериев соответствия воспроизведенного ЛС брэнду. Доказательства терапевтической идентичности имеют особое значение для препаратов, предназначенных для длительного применения при лечении заболеваний, влияющих на уровень смертности, таких как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, цереброваскулярные болезни, сахарный диабет, бронхиальная астма, а также для антибактериальных средств. Широкое распространение исследования по оценке подобия копий оригинальным ЛС получили на Западе в 80–90-х гг. ХХ в. В результате в ряде стран были созданы реестры, в которых, для удобства врачей и потребителей, генерики представлены в виде двух категорий: с доказанной терапевтической эквивалентностью и без таковой. Примером является публикуемая в США «Оранжевая книга» (Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluation) [6]. В Украине в связи с преобладанием на рынке воспроизведенных ЛС проблема их идентичности брэндам чрезвычайно актуальна, и ее научные аспекты достаточно широко обсуждаются многими специалистами [1–5, 7–9], однако экспериментальная оценка основных биофармацевтических показателей копий пока не получила должного распространения.

Для характеристики качества генериков ключевым является понятие биоэквивалентности, которое предполагает соответствие фармацевтических и терапевтических показателей у оригинального и воспроизведенного ЛС. Следует подчеркнуть, что фармацевтическая (химическая) эквивалентность не тождественна биоэквивалентности. ЛС являются фармацевтически эквивалентными, если они содержат один и тот же АФИ в одинаковых концентрациях (дозах) и вводятся в организм одним и тем же путем. При этом не обязательна идентичность состава вспомогательных веществ, цвета, вкуса. Биоэквивалентными ЛС могут быть признаны тогда, когда они: а) фармацевтически эквивалентны или альтернативны (содержат один и тот же АФИ, но в виде разных солей) и соответствуют принятым фармакопейным стандартам (содержание АФИ, состав сопутствующих примесей и остаточных растворителей, скорость высвобождения из лекарственной формы, растворимость АФИ и др.); б) их фармакокинетические показатели, главным образом биодоступность (AUC_0-t, С_max, t_max), различаются не более чем на 20 %; в) они произведены с соблюдением требований GMP. В Европейском руководстве по биодоступности и биоэквивалентности указано, что «два лекарственных препарата являются биоэквивалентными, если они фармацевтически эквивалентны/альтернативны и при этом их биодоступность после приема в одинаковой молярной дозе совпадает в той степени, что их действие с точки зрения как эффективности, так и безопасности будет по существу одинаковым» [10]. Таким образом, генерическим препаратом следует признать ЛС, которое имеет такой же качественный и количественный состав активных субстанций и такую же лекарственную форму, как референтный препарат и чья биоэквивалентность референтному препарату подтверждена соответствующими исследованиями биодоступности [11]. Действительно, если фракции абсорбировавшегося АФИ одинаковы, то человеческий организм всегда сделает с всосавшимся лекарственным веществом (ЛВ) одно и то же, и это, согласно мнению авторов публикации [12], оправданно даже для болезненного состояния.

Для оценки терапевтической эквивалентности ЛС приняты следующие виды исследований:

— сравнительные исследования биодоступности in vivo на людях. При этом допускается проведение тестов in vitro при условии их доказанного соответствия показателям обоснованности и валидации, определенным in vivo на людях;

— сравнительные фармакодинамические исследования на людях;

— сравнительные клинические испытания;

— тесты на растворение in vitro.

Пребывание ЛВ в организме принято разделять на две фазы: фармакокинетическую (абсорбция, распределение, метаболизм, выведение) и фармакодинамическую (взаимодействие со специфическими мишенями, в результате которого возникает биологический ответ).

Биодоступность — количественная характеристика процесса абсорбции (всасывания) АФИ. Ее определяют как относительное количество ЛВ, которое в неизмененном виде достигает системного кровообращения (степень биодоступности), и скорость, с которой этот процесс происходит (скорость всасывания). Абсолютная биодоступность имеет место тогда, когда вся введенная доза ЛВ поступает в кровообращение и соответствует дозе, установленной при внутривенном введении этого же вещества. В том случае, когда невозможно осуществить внутривенное введение ЛС, проводят сравнение между двумя разными пероральными формами, а полученное при этом значение носит название относительной биодоступности [13–15].

Количественно биодоступность оценивают для одной дозы по максимальному уровню концентрации ЛВ в крови или плазме (С_max), времени наступления максимума концентрации (t_max) и площади под кривой зависимости «концентрация ЛВ — время» (AUC — area under the curve). Изменение концентрации ЛВ выражают уравнением

dC/dt = –k_eC

или в интегральном виде:

C = C₀e^–kek,

где С — концентрация в данный момент времени, С₀ — введенная доза, k_e — константа скорости элиминирования, t — время.

Чаще используют логарифмическую форму:

ln(C₀/C) = k_et;

lnC = lnC₀ – k_et.

В графическом виде изменение концентрации ЛВ в зависимости от времени представлено на рис. 1.

При этом график на рис. 1а соответствует простейшей однокамерной фармакокинетической модели, а график на рис. 1б — однокамерной модели с всасыванием [13]. В расчетах используют значение суммарной площади под кривой концентрации ЛВ от момента его попадания в организм до полного удаления из него. Математически AUC представляет собой интеграл:

Во многих случаях рассчитывают не полную площадь под кривой, а ее часть за определенный промежуток времени, как правило, равный интервалам между двумя последовательными введениями ЛС.

Еще один важный параметр — среднее время удержания ЛВ в организме (mean residence time — MRT) — представляет собой отношение:

MRT = AUMC/AUC,

где AUMC (area under the moment curve) математически выражается как интеграл от произведения времени на концентрацию:

AUMC = ∫tCdt.

Отношение С_max/AUC_0–∞ принято как характеристика скорости всасывания. Абсолютную биодоступность (F_abs) определяют, сравнивая AUC при пероральном и внутривенном введении одного и того же ЛС, как

F_abs = ((AUC_{per os}/AUC_iv) ∙ (C_iv/C_{per os})) ∙ 100 %.

Такие исследования входят в программу изучения фармакокинетических показателей при разработке оригинальных ЛС. При сравнении двух пероральных форм устанавливают относительную биодоступность (F_rel) как

F_rel = ((AUC_{per os}(test)/AUC_{per os}(stand)) ×
× (C_{per os}(stand)/C_{per os}(test))) ∙ 100 %.

Описанный метод можно применять и для оценки воспроизведенных ЛС. В этом случае в качестве тестируемого препарата выступает генерик, а стандарта (референтного ЛС) — брэнд.

Следует подчеркнуть, что абсорбция может быть неполной, а следовательно, и биодоступность не 100% по причинам:

— нестабильности вещества в кислотной среде желудка;

— недостаточного времени пребывания на абсорбирующей поверхности кишечника;

— метаболизма под действием микрофлоры кишечника;

— метаболизма в кишечнике под действием пищеварительных ферментов;

— первичного метаболизма в печени;

— биофармацевтических факторов.

Для большинства генериков решающее значение имеют именно биофармацевтические показатели, такие как скорость высвобождения АФИ и его растворимость. Поэтому исследования биоэквивалентности не требуются для растворов, предназначенных для парентерального введения, растворов для приема внутрь, газов, ЛС для местного применения несистемного действия, ингаляционных, назальных спреев в виде водных растворов. Необходимыми они являются для всех видов ЛС с системным действием, предназначенных для сублингвального, букального, перорального введения и местного применения немедленного или модифицированного высвобождения, и для комбинированных препаратов постоянного состава, так как существует множество факторов технологического характера, зависящих от производителей (способ получения АФИ и его переработки в готовую лекарственную форму (ЛФ)) и которые влияют на скорость растворения препарата и его всасывание. В связи с этим возникает необходимость выбора методов оценки биоэквивалентности ЛС системного действия. В каких случаях можно ограничиться проведением фармакокинетических исследований in vitro вместо сложных, затратных и этически не всегда безупречных исследований in vivo? Простота и доступность тестов in vitro по сравнению с испытаниями in vivo при оценке биоэквивалентности обусловливает все возрастающий к ним интерес. Однако существует проблема соответствия результатов таких экспериментов. Что касается фармакокинетической фазы, то несовпадение может быть связано с тем, что из-за специфических физико-химических свойств ЛВ отсутствует четко выраженная скоростьопределяющая стадия, и в организме его растворение, всасывание и распределение протекают с соизмеримыми скоростями, которые не контролируются in vitro [7, 16]. Как отмечено выше, исследования in vivo не проводятся для легкорастворимых веществ. Это положение основано на биофармацевтической классификационной системе (BCS — Biopharmaceutics Classification System), согласно которой все лекарственные субстанции подразделяются на четыре класса: 1) высокорастворимые, высокопроницаемые; 2) низкорастворимые, высокопроницаемые; 3) высокорастворимые, низкопроницаемые; 4) низкорастворимые, низкопроницаемые. При этом ЛВ высокорастворимо, если в интервале рН 1,2–6,8 в 250 мл буферного раствора при 37 °С растворяется самая большая доза АФИ, входящего в состав ЛС. ЛВ является высокопроницаемым, если абсорбируется 85 % введенной дозы или более [16]. В США указанная классификация является одним из оснований для замены изучения биодоступности ЛВ на тест in vitro на растворимость. Согласно системе BCS для ЛВ, относящихся к первому и второму классам (высокопроницаемых), как правило, отмечается надлежащая корреляция при сравнении результатов, полученных in vitro и in vivo, а для веществ с низкой проникающей способностью такая корреляция обычно неудовлетворительна. Для ЛС, содержащего АФИ, относящийся ко второму классу, изучение биоэквивалентности in vivo может быть заменено на тесты in vitro, если воспроизведенный препарат растворяется на 85 % и более в буферном растворе при рН 6,8 за ≤ 30 мин, а его профиль растворения подобен таковому у референтного ЛС при рН 1,2; 4,5; 6,8 в тесте «Растворение». Для ЛВ, принадлежащих к третьему классу, замена испытаний in vivo на исследования in vitro возможна только в том случае, когда и копия, и референтное ЛС быстрорастворимы — 85 % и более за ≤ 15 мин при рН 1,2; 4,5; 6,8. Препараты, в составе которых присутствуют АФИ четвертого класса указанной системы, всегда проходят испытания на биоэквивалентность in vivo.

Таким образом, тест «Растворение» является одним из важнейших в оценке биофармацевтического качества ЛС, так как позволяет установить, какие из физико-химических свойств АФИ, ЛФ или какой из параметров технологического процесса их производства могут оказывать решающее воздействие на биодоступность ЛС. Кроме того, он широко используется в системе государственного контроля качества фармацевтической продукции для выявления фальсифицированных препаратов [17, 18]. В связи с этим заслуживают внимания следующие примеры.

Для АФИ высокоэффективного антитромботического препарата клопидогрель [19] характерны: полиморфизм — существование в виде кристаллических форм 1 и 2, отличающихся по физико-химическим свойствам (растворимости, температуре плавления и др.), и стереоизомерия — присутствие оптически активных R- и S-изомеров, различающихся расположением заместителей у асимметрического атома углерода (хирального центра), что проявляется в изменении направления вращения оси поляризованного света. Для большинства фармакокинетических исследований приемлемы нестереоселективные методы оценки содержания ЛВ и его метаболитов. Стереоселективную оценку проводят в тех случаях, когда энантиомеры (оптические изомеры) обладают разными фармакологическими и метаболическими свойствами или отмечается нелинейная зависимость системной биодоступности [20]. Так, у клопидогреля активен только левовращающий S-изомер. Именно он в виде гидросульфата кристаллической формы 2 является АФИ оригинального препарата Плавикс^® [19]. Поэтому при сравнительном анализе качества оригинальной и воспроизведенных ЛФ клопидогреля, а также при изучении их биодоступности широко используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с хиральными (оптически активными) неподвижными фазами [20]. Согласно данным исследования [21], при анализе образцов таблеток клопидогреля 18 производителей из Аргентины, Доминиканской Республики, Индии, Китая, Уругвая методом ВЭЖХ с применением хиральной колонки во всех испытанных пробах было обнаружено завышенное содержание примесей и заниженное содержание S-изомера.

В Украине сравнительный анализ качества четырех копий клопидогреля (Клопигрель, 75 мг (ЮСВ Лтд, Индия), Клопилет, 75 мг («Сан Фармасьютикэл Индастриз Лтд», Индия), Плагрил, 75 мг («Д-р Редди’с Лабораторис Лтд», Индия), Деплатт, 75 мг («Торрент Фармасьютикэлз Лтд», Индия)) и брэнда Плавикс^®, 75 мг («Санофи Винтроп Индастриа», Франция) впервые проведен авторами публикации [4]. В результате установлено, что содержание примесей в исследованных образцах таблеток Клопигрель, Клопилет и Деплатт было существенно завышено по сравнению с референтным ЛС и принятыми фармакопейными стандартами. В частности, Клопигрель и Деплатт не соответствовали брэнду по содержанию правовращающего R-изомера. Профиль растворения (зависимость процента высвобождения АФИ из ЛФ от времени) значительно отличался от аналогичного показателя референтного препарата у образца таблеток Плагрил. Полученные данные свидетельствуют о том, что при несоответствии фармакопейного качества воспроизведенных форм клопидогреля брэнду доказательство их биоэквивалентности по фармакокинетическим параметрам in vivo бессмысленно.

Показательно также проведенное в Италии сравнительное исследование [22] оригинального антидиабетического средства Амарил^® (2 мг глимепирида — производного сульфонилмочевины третьего поколения) компании Sanofi-Aventis и 23 воспроизведенных препаратов таблеток глимепирида: Adiamyl (Lancasco, Гватемала), Amadiab-2 (Lapilaboratories, Индонезия), Bioglic (Biolab Sanus, Бразилия), Diagril (Bukwang, Корея), Diabold (Barrett Hodgson, Пакистан), Diameprid (Abdi Ibrahim Pharmaceuticals, Турция), Dolcyl (Medical Union Pharmaceuticals, Египет), Evopride (Pharmevo, Пакистан), Hanall Glimepiride (Han All Pharmaceutical, Корея), Geliemeiniao Jiaonang (Pudu Pharmaceuticals, Китай), Gla-Dm (Yuhan, Корея), Glimepibal (Laboratorios Baldacci, Бразилия), Glimax (Ali Raif, Турция), Glimepiride (Boryung) (Boryung, Корея), Glimepiride (Hanni) (Hanni, Корея), Glimepirida (Laboratorios la Sante SA, Колумбия), Glimepirida (Esterlina, Бразилия), Glimepirida (Europfarma) (Europfarma, Бразилия), Glimulin-2 (Glenmark Pharmaceuticals, Индия), Glusafe (Genovate Biotechnology Company, Тайвань), Metrix (Kalbe Farma, Индонезия), Panabutol (Panalab, Аргентина), Taboss (Okasa Pharma, Гватемала).

Глимепирид является труднорастворимым, но высокопроницаемым веществом, обладает 100% биодоступностью при введении per os [23], т.е. согласно BCS он относится ко второму классу ЛВ. В этом случае должна соблюдаться надлежащая корреляция результатов, полученных in vitro и in vivo, что, несомненно, повышает значение первых в оценке биоэквивалентности генериков и брэнда Амарил^®.

Перечисленные выше образцы тестировали на содержание в них АФИ, примесей и остаточного растворителя в обычных условиях и через 7, 21 день от начала эксперимента по хранению ЛФ без упаковки при температуре 60 °С (модель «ускоренного старения» ЛС). Сравнивали также профили растворимости брэнда и копий. Требуемые показатели качества: содержание синтетического предшественника глимепирида — сульфамида < I = 2,5 %, допустимое общее количество примесей < I = 3,5 %; растворение ≥ 85 % в течение 15 мин; количественное определение АФИ: 90 –102 %; содержание остаточных растворителей: метанола < I = 1400 ppm, этанол — отсутствует. Содержание АФИ во всех образцах находилось в указанных пределах. Результаты испытаний по остальным показателям представлены на рис. 2–6 [22]. Из них следует, что 74 % копий (17 из 23) не соответствовали брэнду по какому-либо из критериев. Больше всего образцов (15 из 23) имели существенные различия именно в профилях растворения по сравнению с оригинальным ЛС.

Следует подчеркнуть, что тесты на содержание АФИ, сопутствующих примесей и остаточных растворителей являются фармакопейными требованиями и характеризуют чистоту препаратов, а тест «Растворение» позволяет выявить фальсификаты и является первым этапом в оценке биоэквивалентности. Следовательно, если в ходе экспериментов in vitro доказано, что воспроизведенные ЛС неадекватны по качеству оригинальному препарату, то нет смысла в проведении их испытаний in vivo.

Для испытания всасываемости ЛВ in vitro наиболее распространенной моделью в настоящее время является культура клеток колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 [24–28]. Эти клетки экспрессируют большинство ферментов ворсистого слоя и обладают многими транспортными системами, присущими кишечным абсорбирующим энтероцитам, а высокая спонтанная дифференциация при нормальных условиях культивирования делает их самой доступной моделью для изучения эпителиальной проницаемости ЛВ [24–26]. С целью минимизации различий в значениях коэффициентов проницаемости Сасо-2 для одного и того же препарата, измеренных в разных лабораториях, были отобраны образцы соединений, произведенных Janssen Pharmaceutica, и протестированы в Lion Bioscience Inc. По этим данным с помощью соответствующих компьютерных программ можно построить корригирующие кривые при подсчете проницаемости, измеренной в любой лаборатории [27]. Качество же самой модели Сасо-2 оценивают, сопоставляя экспериментальные коэффициенты проницаемости для трех референтных препаратов (метотрексата, пропранолола гидрохлорида и тестостерона) с их стандартными значениями. Если отклонение не превышает 20 %, модель является приемлемой для дальнейших испытаний [28]. Следует отметить, что определение проницаемости ЛВ на культуре Сасо-2 сегодня возможно проводить и в Украине [7].

Сравнительное исследование всасываемости трех различных ЛВ — феноксиметилпенициллина (в виде натриевой соли), левофлоксацина и глимепирида in vitro на культуре клеток Сасо-2 и биодоступности in vivo описано в работе [29]. Первые два вещества относятся к высокорастворимым (для феноксиметилпенициллина натрия ≥ 100 мг/мл независимо от рН раствора и 200 мг/мл в интервале рН 2–5 для левофлоксацина), а глимепирид — к низкорастворимым (при рН 7,8 — 0,02 мг/мл). Экспериментально установленный in vitro показатель проницаемости Р_арр глимепирида составил 30,4 × 10^–6 см/с, феноксиметилпенициллина натрия — 25,8 × 10^–6 см/с и левофлоксацина — 27,0 × 10^–6 см/с, что позволяет отнести их к высокопроницаемым ЛВ.

При проведении теста «Растворение» для таблеток, содержащих 780 мг феноксиметилпенициллина натрия и 500 мг левофлоксацина, показано, что 80 % АФИ переходит в раствор в течение 30 мин. За то же время растворяется 90 % от 1 мг глимепирида.

Определение биодоступности in vivo ЛФ этих веществ, произведенных Hoechst Marion Roussel GmbH (Германия) в виде растворов для внутривенного и перорального применения, а также таблеток по 780 мг феноксиметилпенициллина натрия, покрытых оболочкой (Isocillin^®), 1 мг глимепирида (Амарил^®) и 500 мг левофлоксацина (Tavanic^®), было проведено у здоровых добровольцев (14, 12 и 18 человек в группе соответственно) при однократном введении. Концентрацию ЛВ в плазме контролировали методом ВЭЖХ.

Установлено, что 60 % левофлоксацина и 80 % феноксиметилпенициллина достигают системного кровообращения в течение 30 мин, а та же часть введенной дозы глимепирида (в виде водного раствора для перорального применения) регистрируется в крови уже через 15 мин. Однако в случае использования таблеток глимепирида 80 % введенной дозы поступает в системное кровообращение лишь через 3,5 ч (рис. 7).

Следовательно, согласно классификации ВCS натриевая соль феноксиметилпенициллина и левофлоксацин относятся к первому, а глимепирид — ко второму классу. Тем не менее у обоих антибактериальных ЛВ, несмотря на ожидаемую удовлетворительную корреляцию между результатами измерений in vitro и in vivo, отмечена зависимость абсорбции in vivo от заполнения желудка. А для глимепирида нет соответствия между результатами тестов in vitro и in vivo для таблеток, что, вероятно, обусловлено низкой рН-зависимой растворимостью данного ЛВ. Эти результаты наглядно демонстрируют необходимость исследования абсорбции in vivo для всех низкорастворимых ЛВ.

Клинические испытания биоэквивалентности ЛС на здоровых добровольцах строго регламентированы [10]. Им предшествует ряд предварительных этапов: выбор дизайна исследований (однократная/многократная доза; перекрестный дизайн, дизайн с параллельными группами, воспроизводимый дизайн), разработка протокола, создание этического комитета, разработка информационного листа для пациента, документальной формы согласия на участие в испытаниях и индивидуальной регистрационной формы, а также определение процедуры набора участников.

В протоколе исследований обязательно должны быть учтены данные о препарате (сертификат, состав, растворение in vitro, соответствие нормам GMP) и его фармакокинетике, о наличии побочных эффектов и в связи с этим приемлемость его применения здоровыми добровольцами, выполнены ориентировочные расчеты измерительного периода и/или периода вымывания, чтобы установить возможность проведения перекрестного исследования, отобраны биоаналитические методы и установлен измеримый предел концентрации ЛВ в плазме с целью определения количества приемов ЛС.

При отборе испытуемых, количество которых должно составлять не менее 12 человек в группе (в Европе: здоровые, 18–55 лет, в США: обоих полов > 18 лет), учитываются индивидуальные данные каждого добровольца (курение, вегетарианство, фенотипирование) и требуется медицинское подтверждение удовлетворительного состояния здоровья (клинический анализ крови, ЭКГ, АД), проводится рандомизация. Критерии включения и исключения участников испытаний должны быть обоснованными. Страхование добровольцев является обязательным. Испытуемые должны придерживаться требований исследования, но каждый в любой момент волен прервать свое участие в эксперименте, при этом в протоколе регистрируют причину выбывания.

Стандартизация процедуры приема ЛС состоит в выборе времени введения препарата (до или после приема пищи), установлении объема жидкости, вводимой с ЛС, и контроле приема, установлении рациона, исключении алкоголя, ограничении поступления тех компонентов пищи, которые могут оказать влияние на самочувствие испытуемых или изменяют метаболизм ЛВ (ксантины: кофе, шоколад; жевательная резинка, грейпфрут), ограничении физической активности.

Требования к исследуемым образцам: отбор проб проводят с учетом того, что их количество должно быть достаточным для описания ≥ 80 % общей AUC (3–4 для характеристики «вхождения» ЛВ, 3 вокруг пика С_max, 3–4 для описания элиминации, обычно 12–18 проб). Фаза вымывания составляет 3–4 периода полувыведения АФИ из организма, при этом учитывают уровень метаболизма и предел обнаружения исследуемого ЛВ в образцах. Подготовка пробы к измерениям включает изготовление плазмы или сыворотки, маркировку, хранение, транспортировку.

При наличии сложностей в определении концентрации ЛВ из-за его низкого содержания в ЛФ, нестабильности в биологической среде, короткого периода полувыведения, при наличии активных метаболитов, нелинейной фармакокинетике или тогда, когда АФИ является пролекарством, а также в некоторых других предусмотренных соответствующими руководствами случаях проводят определение содержания не ЛВ, а его метаболитов в плазме (сыворотке, крови). Если концентрация в крови слишком мала для определения и более 40 % ЛВ выводится с мочой в неизмененном виде, то моча также может служить биологической средой для отбора проб. При этом точки отбора должны соответствовать 7–10 периодам полувыведения АФИ [15].

При выборе биоаналитического метода учитывают пределы количественного анализа (0,1 предполагаемого пика концентрации должна быть измерима), концепцию валидации, возможность оценки вклада метаболитов. В протоколе указывают методы расчетов, первичные характеристики, трансформацию биоаналитических данных в биостатистические расчеты, ремонт выборки, возможные объяснения различий между препаратами и пределы допустимости таких различий. В связи с этим следует особо подчеркнуть, что при проведении клинических исследований эквивалентности двух ЛС невозможно получить полностью совпадающие результаты. Задача таких исследований состоит не в том, чтобы выявить преимущества одного препарата в сравнении с другим, а в том, чтобы подтвердить или опровергнуть гипотезу о статистически несущественных отличиях в их эффективности. Для заключения об отсутствии различий в фармакокинетических параметрах тестируемого и референтного ЛС применяется дисперсионный анализ и выполняется расчет 90% доверительных интервалов [30, 31]. Эквивалентность является подтвержденной, если 90% доверительные интервалы соотношений параметров биодоступности исследуемого препарата не выходят за пределы 80–125 % показателей референтного ЛС. Однако максимально допустимое отклонение от величины соответствующего фармакокинетического параметра у ЛС, принятого за стандарт, составляющее в большинстве испытаний 20 %, по мнению многих авторов, является весьма неоднозначным и противоречивым показателем. Причем некоторые специалисты считают, что отклонение не должно превышать 10 % [32], другие допускают даже 50% отличие [33]. Следовательно, в каждом конкретном случае величина отклонения должна рассматриваться отдельно, исходя в первую очередь из величины терапевтического индекса препарата.

В литературе приведены результаты нескольких сравнительных испытаний оригинальной и многоисточниковых (генерических) ЛФ вышеупомянутого антидиабетического средства глимепирид, реализованных в условиях клиники. Так, независимой исследовательской группой в Афинах (Греция) проведено тестирование двух пероральных форм глимепирида по 4 мг Salosa^® (Aventis Pharm Inc., США) и Glimepiride (Specifar, Греция) с участием 24 здоровых добровольцев обоих полов [34]. Отбор проб крови осуществляли до приема препарата и в 14 временных точках в течение 24 ч после введения ЛС. В качестве биоаналитического метода использована ВЭЖХ, анализируемые показатели: AUC_(0-∞), AUC_(0-last) для установления С_max и t_max. Статистическая оценка полученных значений AUC_(0-∞), AUC_(0-last) и С_max проведена после полулогарифмического преобразования по методу ANOVA. Значения t_max оценены с применением интервала свободного распределения по Hodges — Lehman.

Согласно оригинальным данным [23], Амарил^® обладает 100% биодоступностью при введении per os, С_max в плазме регистрируется через 2–3 ч после введения, t_1/2 при однократном приеме составляет 5–8 ч, кинетика в диапазоне доз 1–8 мг линейна и для него не отмечено влияния состава пищи на образование метаболитов, что должно обеспечивать хорошую воспроизводимость фармакокинетических показателей для брэнда и его копий при надлежащем качестве последних. Это подтверждают результаты тестирования (табл. 1). Статистическая оценка анализируемых параметров приведена в табл. 2. Полученные данные [34] позволили сделать вывод о том, что воспроизведенная ЛФ глимепирида является биоэквивалентной оригинальному ЛС Salosa^®.

Авторами публикации [35] представлены результаты рандомизированного клинического исследования инновационного глимепирида и его генерической копии, проведенного Военно-медицинской академией и Национальным токсикологическим центром Сербии. ЛС были испытаны на 24 здоровых добровольцах в дозе 6 мг. Содержание АФИ в сыворотке контролировали в течение 48 ч, в качестве валидированного биоаналитического метода также использовали ВЭЖХ с детектированием в ультрафиолетовом диапазоне. Согласно данным работы [35], AUC для тестируемого и референтного препаратов совпали на 90 %, а различия в t_max и t_1/2 были статистически незначительны. На этом основании сделан вывод о биоэквивалентности генерика брэнду.

Анализ результатов исследования фармакокинетических показателей in vivo свидетельствует, что соблюдение всех требований, предъявляемых к такого рода испытаниям, и получение статистически достоверных данных — достаточно сложная задача. С 1995 г. ВОЗ проводит инспекцию клинических испытаний биоэквивалентности. До 2005 г. было проверено 78 досье, в 73 из них обнаружены недостатки: не признаны данные в 28 (38 %), отозваны 3 (4 %) заявки на регистрацию и приостановлена регистрация 3 (4 %) препаратов, проведена коррекция данных в 6 (8 %), критические данные выявлены в 40 (55 %) из 73, фальсификация результатов зафиксирована в 20 (27 %) досье [36]. В связи с этим неизбежно возникают вопросы: является ли фармакокинетическая эквивалентность доказательством терапевтической и достаточное ли это основание для замены брэнда на воспроизведенное ЛС? В первую очередь критически рассматривается величина максимально допустимых клинически важных отличий показателей AUC, C_max, t_max, в настоящее время составляющая 20 %. Особое значение это имеет для ЛС с низким терапевтическим индексом. Ряд специалистов [32] предлагает снизить ее до 10–15 %. Неоднозначно оценивается и проведение испытаний единственной суточной дозы препарата на небольшой группе здоровых добровольцев. В реальных условиях ЛС назначают пациентам разного возраста, находящимся к тому же не в стандартизованных условиях клинических испытаний, а под влиянием различных, трудно учитываемых факторов (рацион, физическая активность, прием иных ЛС). Однако следует признать, что и у оригинальных препаратов на этапе пострегистрационного (маркетингового) применения могут быть выявлены неблагоприятные побочные эффекты или происходит корректировка установленной суточной дозы, так как ЛС воздействует на большее количество пациентов, чем во время клинических испытаний. Например, поражение сердечных клапанов при приеме фенфлурамина зарегистрировано через 24 года после появления препарата на рынке, главным образом благодаря более широкому его назначению как аноректического средства [37].

Проблема выбора между оригинальными и многоисточниковыми препаратами неисчерпаема. Для оценки рисков, связанных с заменой брэндов на воспроизведенные ЛС, врачи должны опираться на надежные данные об их надлежащем качестве, безопасности и клинической эффективности. При этом показатели фармацевтической и фармакокинетической эквивалентности являются необходимыми, но далеко не достаточными условиями терапевтической эквивалентности, для доказательства которой нужны клинические испытания.