Международный эндокринологический журнал Том 15, №1, 2019

Вступ

Загальновідомо, що цукровий діабет (ЦД) — захворювання, що проявляється насамперед за рахунок своїх ускладнень, які визначають його тяжкість, ранню інвалідизацію і передчасну смертність населення [1, 2]. Для формування судинних ускладнень ключовим є поняття ролі судинного ендотелію, що є динамічною регулюючою системою як при фізіологічних, так і при патологічних процесах [3, 4]. Ендотеліальна дисфункція (ЕДФ) формується при запаленні судин, атеросклерозі, артеріальній гіпертензії (АГ), кардіоміопатії, ретинопатії, нейропатії [4, 5].

Останнім часом доведена важлива роль генетичних факторів, що відіграють етіологічну роль як чинники, що сприяють виникненню метаболічних захворювань, у тому числі ЦД 2-го типу [5–12]. Ще в метааналізі Z.H. Liu (2013), до якого увійшли 10 досліджень (1425 хворих на ЦД 2-го типу та 1116 — із групи контролю), у китайського населення популяції Хан було встановлено наявність зв’язку алелі А поліморфізму rs1800629 гена TNF-α (відношення шансів (ВШ) = 1,63; 95% довірчий інтервал (ДІ) 1,17–2,25) та генотипів за домінантною моделлю успадкування (G/A + AA) проти G/G (ВШ = 1,47; 95% ДІ 1,17–1,85) [5]. Такий результат метааналізу показав, що поліморфізм rs1800629 гена TNF-α був сильно пов’язаний із ризиком ЦД 2-го типу і алель А є алеллю ризику.

З іншого боку, у пакистанському дослідженні встановлено, що хворі на ЦД 2-го типу з популяції Панджабі Ражпут не мали мінорної алелі А поліморфізму rs1800629 гена TNF-α [6], хоча рівень TNF-α у них був істотно більшим, ніж у контрольній групі. З іншого боку, дослідженнями Програми 1000 Genomes Project Phase 3 (http://www.internationa lgenome.org/) показана наявність мінорної алелі А в представників Східної Азії (f = 0,059), а в численних дослідженнях показано, що у хворих на ЦД 2-го типу частота цієї алелі збільшена (до 0,11–0,20) [5, 9, 11, 13].

Дані австралійського дослідження (2494 особи з ЦД 1-го і 2-го типу) показали, що алель А поліморфізму rs1800629 гена TNF-α була пов’язана з розвитком ЦД 1-го типу (р < 0,001), але не з ЦД 2-го типу та розвитком діабетичної ретинопатії (ДР) [7]. Також і дослідження [8], що було проведено у 205 північно-східних бразильських хворих на ЦД 1-го типу, показало наявність такого зв’язку для поліморфізму rs1800629 гена TNF-α.

На відміну від результатів дослідження [7] у бразильському дослідженні [9] (745 хворих на ЦД 2-го типу, у тому числі 331 особа без ДР, 246 — із непроліферативною і 168 — із проліферативною ДР) показано що частота алелі А поліморфізму rs1800629 гена TNF-α була суттєво вищою у хворих із проліферативною ДР, ніж в інших групах хворих (р = 0,035), та мала асоціацію з її розвитком за домінантною моделлю успадкування (ВШ = 1,82; 95% ДІ 1,11–2,98). У наших попередніх дослідженнях показано, що різні ускладнення ЦД 2-го типу можуть бути пов’язані з різними поліморфними ДНК-локусами [10].

В індійських дослідженнях [11–13] показана наявність асоціації поліморфізму rs1800629 гена TNF-α з розвитком ЦД 2-го типу. Крім того, у дослідженні [11] показана наявність асоціації цього поліморфізму з діабетичною виразкою на стопі та приростом рівнів у крові IL-6, TNF-α і хемокіну SDF-1 у таких хворих. У роботі [13] визначено, що поліморфізм гена TNF-α -308G/A був потужним фактором ризику ЦД 2-го типу, особливо для хворих віком понад 45 років.

В системному огляді публікацій із 2000 по 2016 рік, виконаному G.I. Luna та співавт. (2016), звернуто увагу на суперечливість результатів визначення впливу поліморфізму rs1800629 гена TNF-α на розвиток ЦД 2-го типу в різних популяціях, що, на думку авторів, пов’язане з етнічними розходженнями та диктує необхідність таких досліджень у кожній популяції окремо [14].

Таким чином, наведені дані мали суперечливий характер і, хоча загалом вказували на наявність зв’язку промоторного поліморфізму rs1800629 (-308G/A) гена TNF-α з ЦД 2-го типу, також підкреслювали необхідність проведення таких досліджені у хворих з окремих етнічних груп.

Мета дослідження: визначити зв’язок поліморфізму rs1800629 гена TNF-α з ЦД 2-го типу в українських хворих, а також зв’язок із розвитком ускладнень і чинниками ЕДФ.

Матеріали та методи

До дослідження залучено дані 152 хворих із ЦД 2-го типу, які не мали родинних зв’язків та були етнічними українцями. Вік пацієнтів становив від 34 до 80 років, у середньому — 53,9 ± 8,4 року. Жінок було 95 (62,5 %), чоловіків — 57 (37,5 %). Згідно з клінічними рекомендаціями [1, 15, 16] за результатами клініко-лабораторних обстежень визначали наявність діабетичних ретинопатії, нефропатії — за рівнями альбумінурії та швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ), сенсорної полінейропатії, макроангіопатії нижніх кінцівок та АГ. Відповідно до клінічної класифікації [16] перший ступінь тяжкості не був виявлений у жодного пацієнта, другий — у 120 (78,9 %) та третій — у 32 (21,1 %) хворих. До контрольної групи були залучені 95 практично здорових осіб відповідного вікового та гендерного розподілу, які не мали порушень вуглеводного обміну.

У крові визначали маркери ЕДФ: біохімічними методами — вміст оксиду азоту (NO) і дієнових кон’югат (ДК) на спектрофометрі Specord (Німеччина); імуноферментним методом — ендотеліну-1 (ЕТ-1; Biomedica Immunoassays, Австрія), ендотеліальної NO-синтази (eNOS; BCM Diagnostics, США) і фактора некрозу пухлини (TNF-α; Bender Medsystems, Австрія). Інтенсивність забарвлення продукту ферментативної реакції кількісно вимірювали на фотометрі Multiscan EX, Thermo Electron Corp. (Фінляндія).

Аналіз поліморфізму rs1800629 гена TNF-α (SNP у промоторному регіоні -308G/A; генна локалізація 6p21.33) проведено методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (контекстна послідовність GAGGCAATAGGTTTTGAGGGGCATG[A/G]GGACGGGGTTCAGCCTCCAGGGTCC) в автоматичному ампліфікаторі Gene Amp^® PCR System 7500 (Applied Biosystems, США). На першому етапі дослідження виконували виділення геномної ДНК із цільної венозної крові з використанням стандартних реактивів PureLink^® Genomic DNA Kit For Purification of Genomic DNA; виробник — Invitrogen (США). Аналіз поліморфізму здійснено з використанням уніфікованих тест-систем TaqMan Mutation Detection Assays Life-Technology (США).

Для статистичної обробки отриманих даних використовували програму Statistica 10 (StatSoft, Inc., США). Після проведення тестів Колмогорова — Смирнова, Андерсона — Дарлінга і χ-квадрат був установлений відмінний від нормального характер розподілу варіаційних рядів (p < 0,05), відповідно, для описової статистики кількісних даних показників ЕДФ використовували медіану (Me) та перший і третій квартилі (Q1; Q3). Незалежні вибірки порівнювали із застосуванням критеріїв Kruskal — Wallis (H) і Mann — Whitney (U). Для порівняння категоріальних змінних використовували таблиці спряженості і непараметричні критерії х-квадрат (χ²) Пірсона у модифікації Йейтса. У всіх випадках статистичного оцінювання значущість відмінностей враховували при значенні p < 0,05.

Результати

На першому етапі результати розподілу генотипів й алелей у контрольній групі, що було отримано в нашому дослідженні (рис. 1), було порівняно з результатами Програми 1000 Genomes Project Phase 3 (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Population?v=rs1800629;vdb=variation).

У Програмі для визначення частот генотипів rs1800629 гена TNF-α були залучені 2504 людини. Предковий генотип G/G був визначений із частотою 0,827 (у наших дослідженнях — 0,663), гетерозигота G/A — 0,165 (у наших дослідженнях — 0,284), мінорна гомозигота Т/Т — 0,008 (у наших дослідженнях — 0,053); для європейської популяції (n = 503) частоти становили відповідно 0,744; 0,245 та 0,012. Отже, наші результати більшою мірою збігалися з результатами для європейської популяції.

При порівнянні розподілу алелей у контрольній групі (рис. 1) із даними Програми 1000 Genomes Project Phase 3 встановлено, що для всіх спостережень (n = 5008) предкова алель G була визначена з частотою 0,910 (у наших дослідженнях — 0,805), мутантна алель Т — 0,090 (у наших дослідженнях — 0,195); для європейської популяції (n = 1006) показники становили відповідно 0,866 та 0,134. Отже, результати контрольної групи і за розподілом генотипів й алелей більшою мірою відповідали даним Програми 1000 Genomes Project Phase 3 для європейської популяції. Визначення статистичної значущості відмінностей розподілів частот у європейській популяції і нашому дослідженні показало такі результати: для генотипів — χ² = 5,38; p = 0,07 та для алелей — χ² = 3,28; p = 0,07). Отже, дійсно суттєвих розбіжностей результатів досліджень визначено не було.

Надалі було проведено статистичне порівняння за двостороннім точним методом Фішера даних із розподілу генотипів й алелей у хворих із такими показниками в контрольній групі. Для цього спочатку було проаналізовано загальну тенденцію частот генотипів й алелей, потім — частотні різниці, які вказували на вплив генотипів й алелей на розвиток захворювання, і на завершення для виявлення відмінностей, значущих за критерієм χ² Пірсона, розглянуто відношення шансів та 95% довірчий інтервал, тобто асоціацію з ЦД 2-го типу (генетичний ризик).

Як свідчили дані, що наведені на рис. 1, у групі хворих відзначалося значуще зменшення частоти предкового гомозиготного генотипу G/G (в 1,3 раза; p = 0,02) порівняно з контролем. Збільшення частот гетерозиготного генотипу G/A та мінорного генотипу А/А (відповідно в 1,4 та 2,0 раза) порівняно з контролем було статистично незначущим (відповідно р = 0,10 та 0,24). Також у хворих відзначалися статистично значуще зменшення частоти предкової алелі G (в 1,13 раза; р = 0,01) та збільшення частоти мінорної алелі А (в 1,45 раза; р = 0,01) порівняно з контролем.

Таким чином, було показано, що розподіл генотипу G/G й обох алелей rs1800629 значимо відрізнявся у хворих на ЦД 2-го типу від контрольної групи. З огляду на це був розрахований вплив розподілу частот генотипів (табл. 1) й алелей (табл. 2) на розвиток ЦД 2-го типу і ступінь їх асоціації з захворюванням. Тест Харді — Вайнберга для групи контролю та випадків ЦД 2-го типу відповідав випадковому характеру успадкування генотипів (відповідно χ² = 0,84; df = 1; p = 0,360 та χ² = 0,60; df = 1; p = 0,438).

Аналіз впливу генотипів за таблицею спряженості (3 × 3) показав відсутність зв’язку з ЦД 2-го типу (χ² = 5,65; p = 0,059). На відміну від цього порівняння частот алелей за таблицею спряженості (2 × 2) показало наявність такого впливу (χ² = 5,91; p = 0,015). Отже, алельний поліморфізм rs1800629 гена TNF-α мав зв’язок із розвитком ЦД 2-го типу, при цьому мінорна алель А збільшувала в 1,7 раза шанси розвитку ЦД 2-го типу (ВШ = 1,71; 95% ДІ 1,11–2,65), тоді як предкова алель G такі шанси зменшувала в 1,7 раза (ВШ = 0,58; 95% ДІ 0,38–0,90).

Таким чином, було показано, що мінорна алель А rs1800629 збільшувала шанси розвитку ЦД 2-го типу і була фактором ризику розвитку цього захворювання: шанси розвитку ЦД 2-го типу у хворих з української популяції — носіїв алелі А rs1800629 були збільшені в 1,7 раза (р = 0,015), тоді як предкову алель G можна було вважати протекторним фактором.

Надалі згідно з планом дослідження була перевірена наявність впливу генотипу rs1800629 на ступінь тяжкості стану хворих і ступінь компенсації ЦД за показниками глікемії та глікованого гемоглобіну (HbA1с), що, на наш погляд, могло би висвітлити наявність впливу генотипу на прогресування захворювання. На жаль, аналіз даних показав, що розподіл і генотипів, і алелей rs1800629 статистичного значення в жодному випадку не мав (р > 0,05). Також була показана відсутність впливу генотипів й алелей rs1800629 на вік хворих, тривалість хвороби, індекс маси тіла, величини систолічного і діастолічного артеріального тиску (р > 0,05).

Логічним у цьому плані здавався подальший пошук впливу rs1800629 на розвиток окремих судинних ускладнень ЦД 2-го типу, результати якого наведено в табл. 3.

Як показали розрахунки, генотипи статистично значуще впливали на наявність нефропатії за швидкістю клубочкової фільтрації (ШКФ) (χ² = 6,38; р = 0,041). На цей самий показник впливав і розподіл алелей (χ² = 6,78; р = 0,009); на інші ускладнення розподіл генотипів (як і алелей) не впливав.

Виявленню зв’язку поліморфізмів генів прозапальних цитокінів (TNF-α, IL-6 і IL-1β) із ЦД 2-го типу і діабетичною нефропатією присвячено комплексне індійське дослідження [18]. Поліморфізм rs1800629 гена TNF-α було визначено в 1326 пацієнтів, серед яких було 448 осіб із ЦД 2-го типу та діабетичною нефропатією, 414 осіб із ЦД 2-го типу без діабетичної нефропатії та 464 — із групи контролю. Найвисоку асоціацію з ЦД 2-го типу за наявності діабетичної нефропатії мав поліморфізм rs1800629 гена TNF-α: для генотипу А/А (ВШ = 2,75; 95% ДІ 1,64–4,59; р = 0,001). Дослідження зв’язку поліморфізму rs1800629 гена TNF-α з розвитком діабетичної нефропатії за рівнем мікроальбумінурії було проведено у 756 хворих на ЦД 2-го типу в роботі [19]. Установлено, що алель А значно підвищувала ризик мікроальбумінурії (ВШ = 2,1; 95% ДІ 0,8–3,7; р < 0,001). Отже, ці дані цілком збігалися з результатами, отриманими в нашому дослідженні: в українській когорті хворих на ЦД 2-го типу мінорна алель А та генотипи (G/A + A/A) були пов’язані з ЦД 2-го типу та розвитком нефропатії в таких хворих.

Надалі було проаналізовано вплив алелей rs1800629 на клініко-лабораторні показники, що –відображали функцію нирок у хворих на ЦД 2-го типу (табл. 4).

Перевірка за критерієм Mann — Whitney показала наявність впливу алелей на ШКФ (U = 8211; р = 0,045). При цьому її рівень був нижчим за наявності алелі ризику А проти предкової протективної алелі G. Це безпосередньо вказувало на патогенетичну роль мінорної алелі А в порушенні функції нирок при ЦД 2-го типу.

Розрахунок для генотипів показав відсутність їх впливу на всі досліджені показники функції нирок (р > 0,05) і в тому числі на ШКФ (р = 0,165).

Вплив поліморфізму rs1800629 на чинники ЕДФ подано в табл. 5.

Вплив генотипів поліморфізму rs1800629 серед всіх чинників ЕДФ виявився при визначенні вмісту в крові ЕТ1 (Н = 7,26; р = 0,026), NO (Н = 59,03; р = < 0,001) і TNF-α (Н = 67,42; р = < 0,001). При цьому рівні в крові всіх чинників були суттєво вищими за наявності генотипу ризику А/А проти предкового генотипу G/G, що особливо проявлялося для TNF-α, рівень якого в носіїв генотипу А/А був вищим у 1,8 раза, ніж у носіїв генотипу G/G (р = < 0,001). Аналогічні результати демонстрував і вплив алелей (за критерієм Mann — Whitney для ЕТ1: U = 7735; р = 0,008; для NO: U = 4157; р = 8,64Е-15 і для TNF-α: U = 3665; р = 2,60Е-17).

Обговорення

У дослідженні [18] показано, що у хворих на ЦД 2-го типу — носіїв мінорного генотипу А/А rs1800629 експресія гена TNF-α була збільшена більше ніж у 4 рази (n-fold = 4,43 ± 1,11), що супроводжувалося суттєвим збільшенням рівнів у крові TNF-α. Також у дослідженні [19] встановлено, що мінорний генотип А/А й алель А rs1800629 значно підвищували рівні в крові TNF-α, що було виражено більшою мірою у хворих із нефропатією. Отже, ці літературні дані разом із отриманими в даному дослідженні встановлювали загальну патогенетичну закономірність: наявність мінорної алелі А є патогенетичним фактором розвитку діабетичної нефропатії, а одним із механізмів розвитку цього стану може бути надлишкова експресія гена TNF-α, що призводить до надмірного синтезу прозапального цитокіну TNF-α. Більший вміст у таких хворих ЕТ1 і NO вказував на залучення і цих чинників ЕДФ у патогенез діабетичної нефропатії, можливо, внаслідок більшого пошкодження ендотелію у хворих — носіїв алелі А.

За сучасними уявленнями, патогенез діабетичної нефропатії — це складний багатовимірний процес, в якому поєднуються запалення, окисний стрес та генетичні чинники [20]. Ключова роль належить гломерулярній гіперфільтрації внаслідок порушення тубулогломерулярного оберненого зв’язку, що зменшує тонус аферентної артеріоли і призводить до гломерулярної гіпертензії. Очевидно, що результати даного дослідження обґрунтовують залучення до цих механізмів і виявлені патогенетичні закономірності.

Відповідно до отриманих результатів можна було дійти висновку, що поліморфізм rs1800629 гена TNF-α мав зв’язок із розвитком ЦД 2-го типу, а серед ускладнень — із розвитком нефропатії за ШКФ. Мінорна алель А сприяла зниженню ШКФ, що пояснювало встановлений факт і реалізувалося через такі чинники ЕДФ, як значне підвищення рівня в крові TNF-α, а також ЕТ1 і NO.

Висновки

1. В українській когорті хворих на ЦД 2-го типу розподіл алелей rs1800629 гена TNF-α пов’язаний із розвитком захворювання (χ² = 5,91; р = 0,015). Мінорна алель А збільшувала в 1,7 раза (ВШ = 1,71; 95% ДІ 1,11–2,65) шанси розвитку ЦД 2-го типу.

2. Наявність алелі А сприяла зменшенню швидкості клубочкової фільтрації, що пояснювало зв’я–зок rs1800629 із розвитком нефропатії (χ² = 6,38; р = 0,041) та було обумовлено розвитком ЕДФ із високими рівнями в крові TNF-α (р < 0,001), ЕТ1 (р = 0,026) і NO (р < 0,001).

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.