Журнал «Здоровье ребенка» 7 (50) 2013

Лиганды RLR

Геликазы RIG-1 и MDA-5 являются высокодифференцированными сенсорами вирусной РНК [59, 85]. Геликаза RIG-1 распознает одноцепочечные РНК (оцРНК), характеризующиеся наличием трифосфатных группировок в их 5 конце (5ppp-оцРНК) [4]. Первоначально в связи с тем, что синтез РНК при помощи РНК-полимераз происходит с использованием нуклеозидтрифосфатов, у всех молекул РНК в их  конце содержится трифосфатный мотив. В дальнейшем процессинге синтезируемой РНК макроорганизма происходит удаление 5ppp и сворачивание РНК в комплексные вторичные структуры, поэтому наличие в цитоплазме клетки экспонированных 5ppp-оцРНК является характерным признаком вирусных двуцепочечных РНК (дцРНК) [7]. Относительно недавно было показано, что наличие 5ppp является важным, но не обязательным условием активации RIG-1 [42, 68, 57, 59]. Однако, по мнению Jan Rehwinkel и соавт. [57, 59], 5ppp-оцРНК является единственным естественным оцРНК-ассоциированным лигандом RIG-1.

Геликаза RIG-1 также участвует в рекогниции относительно коротких дцРНК (в пределах от 21 до 27 нуклеотидов), 3'-ОН- (3'-гидроксильных) и 5-ОН-монофосфатов дцРНК [68]; фрагментов РНК, образующихся в результате противовирусного действия активированной RNase L [70]; регионов, обогащенных поли-U/UC (uridine-rich poly), генома вирусного гепатита С [56, 83]. В отличие от RIG-1 продукт гена MDA-5 распознает относительно длинные дцРНК (более 2 КБ) (рис. 1).

Предполагают, что продукт MDA-5 является доминирующим цитоплазматическим рецептором для полимера РНК поли-(I:C) (polyinosine-polycytidylic) как in vitro, так и in vivo [56].

Протеин RIG-I распознает РНК ортомиксовирусов (вируса гриппа) [2, 53], парамиксовирусов (вируса парагриппа I (вируса Сендай и гемадсорбирующего вируса НА-2) и III типов) [62], мета­пневмовируса [14], респираторно-синцитиального вируса [81], вируса гепатита С [55, 63, 64], краснухи, вируса простого герпеса 1, Эпштейна — Барр вируса [7], вируса везикулярного стоматита [85], японского энцефалита [18], вируса бешенства [1]. В исследованиях, проведенных в последнее время, было показано, что RIG-I участвует в рекогниции и ДНК-содержащих вирусов (вируса Эпштейна — Барр, вируса простого герпеса 1, аденовируса), бактерий (Legionella pneumophila), и синтетической В-формы ДНК поли- (dA:dT) [15, 60].

Геликаза MDA-5 взаимодействует с РНК пикорнавирусов, таких как вирус энцефаломиокардита, менговирус и норовирус [18, 24, 43]. Возможно, что MDA5 участвует в распознавании дцРНК значительно большего спектра вирусных агентов [44].

РНК реовируса и вируса Западного Нила распо­знаются RIG-I и MDA-5 (рис. 2) [21, 26, 34].

Рекогниция лигандов RLR

Геликазы RIG-1 и MDA-5 в неактивированной клетке существуют как аутоингибированные, «закрытые» молекулярные структуры, маскирующие эффекторные CARD домены.

Взаимодействие геликаз RIG-1 и MDA-5 с цитоплазматически расположенной вирусной дцРНК происходит независимо друг от друга и сопровождается димеризацией и индукцией их АТФазной активности (рис. 3) [25].

Инициализация димеризации и открытие CARD доменов для дальнейших CARD-CARD взаимодействий с адаптерной молекулой IPS-1 связано с конформационным изменением пространственной структуры геликазных молекул (рис. 4) [54, 86].

Однако, согласно данным Darja Bamming и Curt M. Horvath [5], уровень продукции IFN I типа, индуцированной MDA-5 или RIG-1, независим от деятельности каталитической области геликазы. Michaela U. Gack и соавт. [52] было установлено, что после рекогниции вирусной РНК аминокислотный остаток Lys¹⁷² RIG-1 подвергается TRIM25-опосредованному убиквитинированию, предопределяя дальнейшее взаимодействие с адаптерной молекулой IPS-1 и трансдукцию сигнала возбуждения. В то время как фосфорилирование аминокислотного остатка Thr¹⁷⁰, который расположен в непосредственной близости к Lys¹⁷², подавляет функциональную активацию RIG-1. Геликазы RIG-1 и MDA-5 возбуждают внутриклеточные сигнальные пути, которые активируют такие факторы транскрипции, как IRF-3, IRF-7 и NFB [22, 64].

До недавнего времени LGP2 считали исключительно ингибирующим фактором. Предполагалось, что геликаза LGP2, связываясь с дцРНК, препятствует активации RIG-1 и MDA-5 и в связи с отсутствием в ее молекулярной структуре CARD доменов сама не вызывает возбуждения продукции IFN I типа [77], а также ингибирует мультимеризацию RIG-1 и MDA-5 [56]. Однако несколькими исследовательскими группами было показано, что LGP2 является не отрицательным, а положительным регулятором RLR-индуцированного возбуждения [40]. Структурные исследования C-терминального домена LGP2, проведенные Kiyohiro Takahasi и соавт. [68], показали, что геликаза LGP2 образует более тесные связи с дцРНК, чем MDA-5. Diana A. Pippig и соавт. [76] предложили модель функционирования LGP2, согласно которой LGP2 и RLR взаимодействуют между собой C-терминальными доменами, обусловливая «раскрытие» CARD доменов (рис. 5).

Образование функционального комплекса LGP2/MDA-5 способствует увеличению возможностей рекогниции, в частности, комплекс LGP2/MDA-5 может взаимодействовать с более значительным разнообразием фрагментов дцРНК, чем MDA-5 [76]. Учитывая, что протеин LGP2, изменяя внутриклеточную локализацию вирусного рибонуклеопротеина (RNP) или раскручивая комплексные структуры РНК, облегчает рекогницию дцРНК преимущественно геликазой MDA-5, Takashi Satoh и соавт. [40] считают, что участие LGP2 особенно важно для рекогниции РНК пикорнавирусов.

Внутриклеточные сигнальные пути RLR

Практически одновременно в 2005 году четыре независимые группы исследователей Taro Kawai и соавт. [35], Etienne Meylan и соавт. [11], Rashu B. Seth и соавт. [67], Liang-Guo Xu и соавт. [84] идентифицировали адаптерную молекулу RIG-1 и MDA-5 — CARD-содержащий стимулятор 1 промотора гена IFN. Каждая группа исследователей дала свое название этой молекуле: Taro Kawai и соавт. [35] — IPS-1, Etienne Meylan и соавт. [11] — Cardif, Rashu B. Seth и соавт. [67] — MAVS, Liang-Guo Xu и соавт. [84] — VISA. Структура адаптерной молекулы ­IPS-1, которая состоит из 540 аминокислотных остатков, характеризуется наличием N-терминального CARD домена и С-терминальной трансмембранной митохондриальной последовательности, связывающей молекулу с внешней мембраной митохондрии. ­IPS-1 является частью макромолекулярного сигнального комплекса [47]. На митохондриальной мембране IPS-1 находится в непосредственной связи с митофузином 1, что позволяет считать IPS-1 активным участником процесса ассоциации митохондрии и эндоплазматического ретикулума, необходимого для трансдукции сигнала [12]. Адаптерная молекула IPS-1 после CARD-CARD взаимодействия с RLR в состоянии вызвать IRF-3-, IRF-7- и NF-B-зависимую активность генов. Дефицит экспрессии IPS-1 сопровождается низким противовирусным ответом [33, 78].

Активация RIG-1 и MDA-5 вирусной дцРНК приводит к раскручиванию вирусной РНК и конформационным изменениям молекул RIG-1 и MDA-5, что обусловливает их взаимодействие с IPS-1 [34]. Активированный IPS-1 может взаимодействовать с несколькими сигнальными (TRAF3, TRAF6, TRADD, RIP1, FADD, RIP1 и каспазами 8–10), регулирующими и другими молекулами [31, 79, 88].

После CARD-CARD взаимодействия как с ­RIG-1, так и с MDA-5 протеин IPS-1 может как рекрутировать TRAF3, так и вступать во взаимодействие с TRADD (tumor necrosis factor receptor 1-associated death domain protein). Индуцированная TRAF3 обусловливает возбуждение TANK/NAP1/SINTBAD и TBK1, которые, в свою очередь, фосфорилируют факторы транскрипции IRF-3 и ­IRF-7. Взаимодействие адаптерной молекулы ­IPS-1 с TRADD активирует сигнальную цепь TRADD/TRAF6/TRAF2/RIP1/FADD/каспаза 8–10/NEMO/TANK/IKKIKK, обусловливая активацию фактора транскрипции NF-B (рис. 6) [35, 44, 49, 70].

Также было установлено, что рекрутирование TRADD может сопровождаться возникновением макромолекулярного комплекса, включающего в себя убиквитин E3 лигазу (паркин), TRAF3, TANK, FADD, RIP1. Данное макромолекулярное образование получило название «иннатеосома». Индуцирующие потенции иннатеосомы в отношении факторов транскрипции IRF3 и NF-B превосходят все известные молекулярные активаторы [27]. Адаптерная молекула IPS-1 также обладает проапоптотическим действием, так как обусловливает изменение митохондриального мембранного потенциала и активирует каспазы [65, 75].

Геликаза RIG-1 в отличие от MDA-5 взаимодействует с молекулярным стимулятором интерфероновых генов STING, который локализован на мембране эндоплазматического ретикулума и обладает способностью индуцировать такие факторы транскрипции, как NFB, IRF-3 [36, 46].

После фосфорилирования и димеризации факторы транскрипции IRF транслоцируются в ядро клетки, где ассоциируются с коактиватором p300/CBP, образуя комплекс IRF/CBP/p300, и связываются с сайтом ISRE промотора ISG. Для TLR-независимого пути активации генов IFN основными факторами транскрипции являются гомодимер IRF-7/IRF-7, гетеродимер IRF-3/IRF-7 [28]. Факторы транскрипции IRF-3 и IRF-7 индуцируют синтез IFN I типа, которые активируют экспрессию сотен ISG, обусловливая продукцию протеинов с противовирусным действием, провоспалительных цитокинов, матурацию незрелых дендритных клеток, активацию эффекторных Т-лимфоцитов [64].

Рассматривая в целом вклад RLR в продукцию IFN I типа, необходимо отметить, что активация RLR сопровождается продукцией IFN I типа эпителиоцитами, макрофагами, дендритными клетками, фибробластами, а основные продуценты IFN, которыми являются плазмацитоидные дендритные клетки (DC), продуцирующие до 90 % всего IFNв организме человека, реагируют не на ­RLR-, а на TLR-ассоциированное возбуждение. В частности, взаимодействия вирусной дцРНК с TLR-3, протеина F респираторно-синцитиального вируса — с TLR-4, вирусной оцРНК — с TLR-7 и TLR-8, CpG бактериальной и вирусной ДНК — с TLR-9 сопровождается продукцией IFN- [30, 45]. Также считают, что некоторые вирусные компоненты непосредственно могут связываться с cis-активными вирус-реагирующими элементами (VRE) промоторов генов IFN, IFN и возбуждать их транскрипцию [6]. Плазмацитоидные DC играют особую роль в раннем интерфероногенезе. TLR-7 и TLR-9 чрезвычайно высоко экспрессированы в плазмацитоидных DC. Взаимодействие вирусной оцРНК с TLR-7 и ДНК с TLR-9 приводят к немедленной активации внутриклеточных молекулярных путей, которые, обусловливая фосфорилирование и транслокацию фактора транскрипции IRF-7 в ядро клетки, индуцируют экспрессию гена IFN [10, 16, 72].

Однако плазмацитоидные DC начинают продукцию IFN только в том случае, если первая макрофагальная линия защиты исчерпывает свои возможности синтеза IFN [69].

Активация RIG-1 в Treg клетках блокирует их ингибирующую функцию [32].

Регуляция активности ­RLR-ассоциированного возбуждения

Ограничение продукции IFN — необходимый физиологический процесс саногенеза острых инфекционных воспалительных заболеваний. Для осуществления ингибирования продукции IFN в макроорганизме функционирует несколько точно отрегулированных механизмов, которые предупреждают развитие хронических IFN-ассоциированных процессов.

Одним из ингибирующих регуляторов активности RIG-1 и MDA-5 является LGP2 [77, 78]. Протеин LGP2 функционирует как лигандсеквестирующий рецептор, конкурирующий с протеинами RIG-I и MDA-5 за взаимодействие с вирусной дцРНК. Таким образом, протеин LGP2 может быть не только положительным, но и отрицательным регулятором передачи сигналов возбуждения с внутриклеточных цитоплазматических геликазных рецепторов. Высокая экспрессия LGP2 подавляет избыточную продукцию IFN, а низкая экспрессия LGP2 способствует интерфероногенезу [37, 77].

Другие молекулярные механизмы подавления IFN-продукции: конкуренция и секвестрация RLR, секвестрация киназ, протеасомная деградация RLR и IPS-1, деубиквитинирование сигнальных молекул и целевых протеинов представлены в табл. 1.

Наличие такого многообразия отрицательных обратных связей точно регулирует уровень активности механизмов противовирусной защиты, предупреждая развитие как аутоиммунного процесса, так и хронического течения воспаления (рис. 7).

Paola M. Barral и соавт. [27] представили всеохватывающий обзор, в котором показали, что вирусы, приобретя в процессе эволюции возможность синтеза особых генных продуктов, которые ингибируют почти каждый шаг RLR-ассоциированного возбуждения, подавляют сенсинг РАМР, трансдукцию сигнала и активацию факторов транскрипции IRF (рис. 8).

В частности, взаимодействие продукта ­RIG-1 и оцРНК физически блокируется неструктурным протеином 1 вируса гриппа (NS1), который в инфицированной клетке образует с протеином ­RIG-1 единый комплекс. А протеин V парамиксовирусов ингибирует функционирование MDA-5 [3, 77]. 3Cpro протеиназа пикорнавирусов, протеаза NS3/4A вируса гепатита C обусловливают деградацию IPS-1 [20]. Протеин V парамиксовирусов способен связываться с TBK1-IKKe и конкурировать с фактором транскрипции IRF3, таким образом пре­дупреждая его фосфорилирование.

Заключение

RLR играют критическую роль в индукции синтеза IFN и воспаления в процессе развития вирусной инфекции. В связи с этим RLR-таргетная терапия может быть новым и перспективным направлением в лечении вирусных инфекций.