Журнал «Болезни и антибиотики» 1 (8) 2013

Диарея является распространенной патологией у госпитализированных пациентов, но причины внутрибольничной (или нозокомиальной) диареи (ВБД) отличны от тех, что приводят к развитию диарей вне стационара. В данной публикации рассматриваются имеющиеся данные об эпидемиологии ВБД и обобщаются современные тенденции в понимании механизмов диареи. В большинстве случаев этиология нозокомиальной диареи неинфекционная и ВБД является осложнением основного заболевания, следствием приема лекарственных препаратов, энтерального питания. За исключением инфекции Clostridium difficile (ИСД), распространенность диарей, вызванных норовирусами, токсигенными штаммами Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca, золотистым стафилококком, Bacteroides fragilis, остается малоизвестной, а возможности их диагностики ограниченны.

ВБД являются частым осложнением у госпитализированных больных, но их причины и значение недооцениваются. Диарея предрасполагает к развитию инфекций, способствует росту заболеваемости и смертности, а также увеличивает продолжительность пребывания в стационаре [1, 2]. Врачи в качестве основной причины диареи часто рассматривают ИСД, но в большинстве случаев в основе заболевания лежат другие причины, такие как прием лекарственных препаратов, энтеральное питание, сопутствующие заболевания, иммуносупрессивные состояния [2, 3]. Согласно данным клинических исследований, диарея развивается у 12–32 % госпитализированных больных, но только ≤ 20 % случаев связано с ИСД [3]. Другие инфекционные причины встречаются редко, но изменения кишечной микрофлоры, присоединение при длительном пребывании в стационаре нозокомиальной инфекции, по-видимому, играют значительную роль у многих пациентов [4–9]. В данной статье будут рассмотрены инфекционные и неинфекционные причины ВБД, а также предложен алгоритм для диагностики и ведения пациентов с нозокомиальной диареей.

Определение

Внутрибольничная диарея является острым эпизодом диареи, которая отсутствовала при поступлении в стационар и возникает через 3 и более суток после госпитализации [7, 10, 22]. О диарее принято говорить, если хотя бы в течение 1 дня имело место ≥ 3 дефекаций с неоформленным стулом или значительное увеличение актов дефекации по сравнению с исходным [10, 11]. Такое определение клинически оправданно, поскольку вероятность развития внебольничной вирусной, бактериальной или паразитарной инфекции спустя трое суток пребывания в стационаре достаточно низкая. Следовательно, врачи могут сосредоточиться на причинах развития диареи, которые более распространены у госпитализированных пациентов.

Клинический спектр болезни

Течение большинства нозокомиальных диарей, если они не вызваны ИСД, нетяжелое, и они проходят через несколько дней, хотя бывают и исключения [10]. Например, токсин-продуцирующие штаммы Clostridium perfringens и Klebsiella oxytoca могут вызвать тяжелые симптомы или колит [9, 12, 13]. Норовирусная инфекция во внебольничных условиях обычно проявляется непродолжительной рвотой, однако у госпитализированных пациентов зачастую длится дольше и может быть особенно тяжелой у больных после трансплантации органов [14]. Лекарственноассоциированная диарея на фоне химиотерапии также может быть тяжелой и клинически неотличимой от ИСД [15].

Заболеваемость

Внутрибольничная диарея является распространенным явлением и регистрируется у 22–32 % пациентов [10]. В недавнем исследовании у 485 госпитализированных пациентов диарея была выявлена в 12 % случаев, в том числе у 27 % больных, госпитализированных на 3 недели и более [3]. В группах высокого риска, таких как пациенты после трансплантации стволовых клеток, диареи обнаруживали в 80 % случаев [16].

Патофизиология

Традиционно различают диареи осмотические, секреторные и воспалительные. Однако у госпитализированных пациентов такое деление представляется упрощенным из-за того, что у них зачастую одновременно имеется несколько факторов: травмы, воспаление, инфекции, изменения диеты, воздействие лекарств и др. [17]. В последние годы большое внимание уделяется роли кишечной микрофлоры, которая представляет собой сложное сообщество, включающее ≥ 10¹³ микроорганизмов, обитающих в кишечнике, и играющее важную роль в поддержании здоровья человека [5, 17]. В здоровом состоянии микробиота и хозяин взаимодействуют на основе взаимного содружества: хозяин обеспечивает источниками питания и окружающей средой, а микробиота участвует в пищеварении, обмене веществ, иммунном гомеостазе, сопротивлении инфекции. У госпитализированных больных прием антибиотиков и другие вмешательства, нарушая этот баланс, вызывают диарею [4–6]. Таким образом, антибиотики широкого спектра действия и большие концентрации антимикробных препаратов в просвете кишечника увеличивают риск развития антибиотикоассоциированной диареи (AAД).

Под ААД подразумевают диарею, развивающуюся на фоне приема антибиотиков и не имеющую других причин. В настоящее время выделяют три основных механизма развития ААД. Во-первых, антибиотики могут оказывать прямое воздействие на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Данный механизм никак не связан с присущей этому классу препаратов антибактериальной активностью. Например, макролиды являются агонистами мотилиновых рецепторов и способны ускорять моторику желудка, вызывая таким образом диарею. Клавулановая кислота, входящая в состав амоксициллина/клавуланата, также способна стимулировать перистальтику тонкого кишечника. А пенициллины в очень редких случаях могут вызывать сегментарный колит [15]. Во-вторых, антибиотики изменяют микробный пейзаж кишечника. Они разрушают бактерии, которые обычно производят бутират, необходимый для эпителиальных клеток толстого кишечника, что приводит к неперевариванию углеводов, эпителиальной дисфункции, повышенной осмотической нагрузке в про­свете кишечника и, как следствие, к диарее [5, 6]. Еще одним потенциальным механизмом для ААД является снижение бактериального метаболизма желчных кислот, потому что желчные кислоты оказывают огромное влияние на секреторную функцию эпителия толстого кишечника [6]. Продолжают изучаться механизмы, посредством которых изменения в микрофлоре приводят к повышенной восприимчивости к инфекциям (например, вы­званной C.difficile) и вносят вклад в развитие диареи, связанной с энтеральным питанием, химиотерапией, лучевой терапией [17]. ИСД также изменяет кишечную флору [9]. Кроме того, важное значение придается индивидуальным различиям в микробном метагеноме, которые могут играть свою роль в предрасположенности пациентов к диарее, инфекции или тяжелой болезни [17].

Дифференциальная диагностика

ВБД отличается от диареи, возникшей вне стационара, по нескольким направлениям. В отличие от острой диареи, которая часто является инфекционным заболеванием, ВБД не связана с эпидемическими опасными периодами [3, 10, 18]. Кроме того, диагностика инфекции у госпитализированных пациентов осложняется высоким уровнем бессимптомного носительства (например, C.difficile) и отсутствием легкодоступных диагностических тестов для выявления других потенциальных инфекционных заболеваний [11, 14, 19]. В свою очередь, быстрое обнаружение инфекционных возбудителей, в особенности C.difficile и норовирусов, способствует быстрому ограничению передачи инфекции другим госпитализированным пациентам [11, 14].

Инфекционные причины ВБД, связанные с приемом антибиотиков

Clostridium difficile

В настоящее время самым значимым энтеропатогеном, вызывающим ВБД, считается C.difficile, на долю которого приходится до 25 % всех случаев ААД и практически все случаи псевдомембранозного колита. C.difficile является грамположительной спорообразующей анаэробной палочкой, получившей свое видовое название (англ. difficult — трудный) из-за ранее имевших место трудностей в культивировании [17]. В исследованиях 30-х годов прошлого века было продемонстрировано ее наличие в ЖКТ у 50 % и более здоровых новорожденных (но не у взрослых). Поэтому она длительное время считалась комменсалом, т.е. естественным обитателем ЖКТ. Однако позже, в 70-х гг. ХХ века, это мнение было опровергнуто. В настоящее время инфекция, вызванная C.difficile, является одной из наиболее частых нозокомиальных (госпитальных) инфекций. Заражение C.difficile происходит из экзогенного источника, путь заражения — фекально-оральный [10]. К концу 4-й недели пребывания в стационаре половина больных инфицируется C.difficile [20]. Споры этого патогена широко распространены в больничной среде (помещения, оборудование, носительство у персонала и пациентов) и могут сохраняться до 40 дней после выписки больного [20]. Таким образом, для развития диареи, обусловленной C.difficile, необходимо сочетание двух условий — изменения состава нормальной микрофлоры кишечника, способствующего колонизации C.difficile, и заражения патогеном из экзогенного источника. Хотя существует свыше 400 штаммов C.difficile, заболевание вызывают только штаммы, продуцирующие токсины [21], которые после эндоцитоза эпителиальными клетками толстого кишечника повреждают актин цитоскелета, обусловливая гибель клеток. Токсин А нарушает связь клеток слизистой толстого кишечника с базальной мембраной и повреждает ворсинчатый эпителий. Токсин В вызывает апоптоз, причем его цитотоксический эффект выражен более чем в 1000 раз сильнее, чем у токсина А. Оба токсина стимулируют макрофаги и моноциты, что посредством интерлейкина-8 способствует инфильтрации тканей нейтрофилами [21]. Выраженность клинических проявлений зависит от факторов риска со стороны пациента, прежде всего от его иммунореактивности. Больные с низким уровнем иммуноглобулинов класса G (IgG) к токсину А склонны к более тяжелому течению заболевания, в то время как лица с высоким уровнем этого иммуноглобулина обычно выздоравливают спонтанно [21]. ИСД, как правило, связана с предшествующим приемом антибиотиков, но может быть следствием действия других факторов, нарушающих кишечную микро­флору [11, 16].

ИСД диагностируется на основании клинических симптомов (таких как диарея) и лабораторного подтверждения наличия токсин-продуцирующего штамма С.difficile в кале. В настоящее время для диагностики ИСД используют иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения токсинов А и В (экспресс-тесты), иммунологический анализ (общий антиген) и метод амплификации нуклеиновых кислот с целью обнаружения генов, кодирующих выработку С.difficile токсинов А и В. Нет необходимости в определении чувствительности С.difficile к антибиотикам с клинической целью, но данное исследование может выполняться в рамках эпидемио­логического надзора [29].

Диагностика ИСД представляет определенные трудности ввиду невозможности провести адекватное тестирование во многих лабораториях. Исследование на выявление токсин-продуцирующего штамма С.difficile в кале должно проводиться всем пациентам с подозрением на ААД. В практической деятельности диагностические тесты для выявления ИСД должны использоваться у всех больных, которые обращаются к врачу общей практики с диареей и с анамнестическими указаниями на недавнее применение антибиотиков (в течение предшествующих трех месяцев, либо если диарея появилась через 3 дня после госпитализации). В группу риска относят пациентов в возрасте старше 65 лет, c хронической сопутствующей патологией, а также больных с отрицательными результатами тестов по поводу других видов кишечной инфекции [30].

Во многих странах уровень осведомленности врачей и других медицинских работников о данной инфекции недостаточный. Низкая настороженность медицинского персонала по отношению к ИСД может привести к неполной диагностике или неправильно поставленному диагнозу. Как следствие: 1) лечение откладывается или не назначено, увеличивается риск тяжелых заболеваний и осложнений; 2) меры инфекционного контроля задерживаются, что может привести к вспышке инфекции; 3) заболеваемость недооценена; 4) увеличивается число назначений ненужных и дорогостоящих диагностических тестов [31].

Специфическая терапия C.difficile-ААД показана больным пожилого и старческого возраста; пациентам с сопутствующей патологией; больным, которым невозможно отменить антимикробный препарат; при сохранении диареи, несмотря на отмену вызвавшего ее антибиотика; при наличии признаков колита (лихорадка, лейкоцитоз, результаты эндоскопии) [11].

Терапия первого ряда включает метронидазол в дозе 500 мг внутрь 3–4 раза в сутки в течение 10–14 дней; его эффективность превышает 90 % [11]. Также эффективен ванкомицин, который является препаратом выбора у беременных, при неэффективности или непереносимости метронидазола и применяется внутрь в дозе 125–500 мг 4 раза в день на протяжении 10–14 дней [11].

Klebsiella oxytoca

Патогенные штаммы K.oxytoca вырабатывают токсин, который ингибирует синтез ДНК [13]. Такие штаммы вызывают 50–80 % случаев геморрагических колитов после приема антибиотиков, не связанных с C.difficile, но, по-видимому, не являются значимой причиной некровянистых ААД [13]. Например, в проспективном исследовании госпитализированных пациентов с ААД цитотоксические штаммы К.oxytoca выявлены у 3 из 18 (16,7 %) пациентов с кровавым поносом, но ни у одного из 89 больных с некровянистой диарей [10]. В недавнем лабораторном исследовании 429 образцов кала, направленном на выявление C.difficile, цитотоксичные штаммы К.oxytoca были выявлены только в 2,3 % случаев. Эти данные подтверждают, что К.oxytoca относительно редко обнаруживается в обычных образцах стула [22]. Болеют преимущественно взрослые. Заболевание начинается остро с болей в животе, кровавого поноса и лейкоцитоза после приема пенициллинов или других антибиотиков [13]. Диагноз подтверждается выделением чистой культуры К.oxytoca (или преимущественно этого микроорганизма) из стула или смывов из толстой кишки. Некоторые «дикие» штаммы К.oxytoca продуцируют токсины, однако доступных в клинике тестов для их идентификации в настоящее время нет [10, 22]. Симптоматика исчезает после прекращения приема антибиотиков; необходимости в специфической терапии, направленной на К.oxytoca, нет [13].

Clostridium perfringens

Продуцирующие энтеротоксин C.perfringens типа А часто вызывают пищевые токсикоинфекции и редко — ААД [9, 12]. Большинство данных о роли C.perfringens в развитии ААД получены в перекрестных исследованиях, в которых продемонстрирована высокая распространенность и большое количество этих бактерий при симптоматической диарее по сравнению с контролем, а также при анализе вспышек ВБД, ассоциированных с C.perfringens и никакими другими патогенами [12]. Тем не менее, по данным крупных исследований, C.perfringens в качестве возможной причины обнаруживают лишь в 1–3 % диарейных образцов, хотя в некоторых работах их доля достигает 8 % [9, 21]. Средняя продолжительность заболевания составляет 7 дней, у каждого пятого больного частота стула ≥ 10 раз в сутки, для лечения используют метронидазол. Сообщений о псевдомембранах в доступной литературе нет [12]. Менее 5 % «диких» штаммов С.perfringens продуцируют токсины, что делает культуральное исследование непрактичным [21]. Для диагностики могут использоваться такие методы, как иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция (ПЦР) [9, 21].

Другие бактерии

Золотистые стафилококки (в особенности метициллинорезистентные токсин-продуцирующие штаммы) вызывают ААД очень редко (0,2–4 %) [9]. Сальмонеллы также редко вызывают ААД и псевдомембранозный колит [6]. Роль Candida spp. (и в частности, Candida albicans) доказана косвенно, на основании ее выявления в кале больных с ААД (свыше 10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г кишечного содержимого) и на основании регрессии симптомов ААД после применения нистатина; однако многие исследователи подвергают сомнению надежность этих доказательств [23].

Инфекционные причины ВБД, не связанные с антибиотиками

Норовирусы — основная причина инфекционного гастроэнтерита — обусловливают до 90 % вспышек во внебольничной среде и 5–30 % госпитализаций по поводу диареи [10, 24]. В больницах норовирусы являются важной причиной вспышек, но частота спорадических инфекций неизвестна [14]. Медиана продолжительности симптоматики составляет 3 дня, однако у больных после трансплантации органов она существенно больше; рвота отсутствует почти в половине случаев [24]. Рота-, астро- и аденовирусы могут вызывать ВБД у маленьких детей [25]. В последние годы к возбудителям внебольничной диареи добавились энтеротоксигенные штаммы Bacteroides fragilis, но их роль в развитии ВБД не изучена [19].

Инфекционная диарея у пациентов с иммунодефицитом часто протекает более длительно и тяжело, хотя бывает и бессимптомное носительство [9]. У больных после трансплантации органов значительную заболеваемость, помимо C.difficile, могут вызывать цитомегаловирусы и желудочно-кишечные вирусы (например, рота-, адено- и норовирусы) [9, 10, 18]. Наконец, паразиты и бактерии, которые обы­чно вызывают внебольничные диареи (например, Giardia spp., Cryptosporidium spp., Strongyloides spp., Campylobacter spp.), были выявлены в условиях стационара и у пациентов после трансплантации. Поэтому, вероятно, их следует учитывать при наличии факторов риска [9, 10, 31].

Неинфекционные причины нозокомиальной диареи

Лекарственно-индуцированные диареи могут быть воспалительного и невоспалительного генеза и являются результатом воздействия на кишечник или на микрофлору [6, 10, 15]. Диарея в качестве побочного эффекта зарегистрирована у более 700 препаратов и развивается у 15–40 % больных, находящихся на энтеральном питании [15, 17]. Поэтому лекарственные препараты и энтеральное питание — наиболее частые причины большинства случаев ВБД, особенно в отделениях интенсивной терапии, онкологических и трансплантологии [6, 16, 18]. Антибиотики, по разным оценкам, ответственны за 5–25 % всех медикаментозных диарей, но и другие лекарственные препараты также могут вызывать нарушения стула (табл. 1) [9, 10, 15]. Чаще всего диареи развиваются на фоне приема противоопухолевых препаратов и иммунодепрессантов, нередки и ятрогенные диареи из-за передозировки слабительных (табл. 1) [10, 15]. Некоторые лекарства содержат сорбит или другие углеводы в качестве наполнителей, которые могут привести к осмотической диарее [2, 15]. Роль энтерального питания как причины диареи можно уменьшить путем непрерывной инфузии и корректировки компонентов и клетчатки, но диарея сохраняется у 10–15 % пациентов [2, 17].

Широкий спектр хронических заболеваний, таких как непереносимость лактозы, воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженного кишечника, диабетические энтеропатии, могут способствовать развитию диареи в больницах. Ишемия кишечника является важной причиной острого кровавого поноса и болей в животе, что чаще наблюдается у пожилых пациентов с сосудистой патологией [27]. У больных в критическом состоянии гипоальбуминемия связана с диареей, но неясно, является ли она основной причиной или маркером тяжести заболевания и недоедания [2]. Аутоиммунные реакции являются частой причиной послабления стула при пересадке кроветворных стволовых клеток [18].

Распространенность и причины диареи в зависимости от группы пациентов

Распространенность и причины диареи у госпитализированных пациентов значительно различаются. У больных, госпитализированных на непродолжительный период времени с небольшим объемом лечебно-диагностических мероприятий, диарея развивается редко (≤ 5 %). При более длительном пребывании в стационаре и интенсивном лечении у госпитализированных в отделения реанимации и интенсивной терапии, по поводу трансплантации органов или химиотерапии опухолей диарея возникает чаще — от 15 до 80 % (табл. 2) [1, 2, 9, 10, 16, 18]. У таких больных бывает сложно определить конкретную причину симптоматики, но некоторые этиологические факторы встречаются чаще, чем другие (табл. 2).

Диагностика и лечение

Диагностика

Первым делом при оценке пациентов с подозрением на ВБД необходимо убедиться в наличии диареи и проанализировать начало, продолжительность и тяжесть симптомов. Следует выяснить частоту, консистенцию и объем стула, оценить любые признаки или симптомы обезвоживания, инфекции или сепсиса. Наличие тяжелых спастических болей в животе предполагает развитие воспалительного процесса, но не является специфичным для инфекции. Рвота также не является специфическим признаком, но может быть проявлением норовирусной инфекции. Кровянистый стул при ААД (или ИСД) встречается редко, за исключением геморрагического колита, ассоциированного с К.oxytoca. В настоящее время при наличии предикторов тяжести течения ИСД нет валидизированных критериев для разграничения ИСД и не-ИСД [10, 11]. Отдельная система классификации используется для диареи, вызванной химиотерапией [26]. ИСД должна быть исключена у всех пациентов с клинически значимой диареей, независимо от приема антимикробных препаратов [11]. Необходимо тщательно собирать анамнез заболевания для исключения всех условий, способствующих возникновению диареи (например, воспалительные заболевания кишечника), а также оценить возможные ятрогенные причины, например передозировку слабительных. Если диарея сохраняется длительно, а прием слабительных средств или ИСД исключен, нужно оценить наличие или отсутствие крови в стуле, иммунный статус и тяжесть симптомов (рис. 1). Следует изучить возможность того, что диарея обусловлена приемом медикаментов (табл. 1) [2, 10, 26]. У больных, находящихся на энтеральном питании, для оптимизации терапии следует оценить скорость и место инфузии, состав компонентов растворов [2, 17]. Определение норовирусов с помощью ПЦР может быть оправданным у больных с обычным уровнем иммунитета при наличии рвоты, у пациентов с ослабленным иммунитетом — при персистировании симптомов, а также при предполагаемых вспышках, когда у нескольких пациентов или медработников, находящихся или работающих в одной и той же палате, наблюдаются сходные симптомы [24]. Тесты на фекальный лактоферрин и другие маркеры воспаления могут быть полезными в отдельных случаях, но в настоящее время нет оснований для их использования в рутинной практике. Тестирование на предмет выявления других инфекционных причин редко приводит к положительным результатам, за исключением, возможно, пациентов после трансплантации внутренних органов [27]. У этих больных следует исключить активную цитомегаловирусную инфекцию и другие желудочно-кишечные вирусы, такие как норо-, адено- и ротавирус, однако большинство случаев диареи обусловлены лекарственной терапией или реакциями отторжения трансплантата [10, 18]. У ВИЧ-инфицированных или лиц, получающих иммуносупрессивную терапию, при наличии факторов риска внебольничных бактериальных или паразитарных инфекций, либо анамнестических указаниях на диарею до госпитализации, допускается культуральное исследование стула или тестирование на предмет выявления паразитов, но эти исследования не следует производить рутинно [10]. У пациентов с кровавой диареей следует исключить ишемию кишечника [27]. Лабораторная диагностика энтеротоксин-продуцирующих штаммов C.perfringens, K.oxytoca и S.aureus, как правило, затруднительна, к тому же большинство штаммов не вырабатывают токсины.

Лечение

У больных с нормальным уровнем иммунитета с нетяжелой диареей применяют поэтапный подход [10, 17]. Отменяют слабительные средства; при наличии ИСД назначают соответствующую терапию [11]. Препараты, способные вызывать диарею, без которых можно обойтись, следует отменить, оптимизируют энтеральное питание, при необходимости проводят заместительную терапию (пероральное или внутривенное замещение потерь жидкости и электролитов) [2, 17]. В некоторых случаях при не-ИСД-диарее могут быть полезными антидиарейные средства. Больные с иммунодефицитом и лица с тяжелой диареей нуждаются в частом мониторинге и ранней, более агрессивной терапии. Лечение диареи, индуцированной химиотерапией, описано в соответствующих руководствах [26]. Всех пациентов с ИСД или норовирусной инфекцией следует как можно раньше изолировать.

Пробиотики показаны для предотвращения ААД в педиатрической практике и для лечения детских инфекционных гастроэнтеритов, но их безопасность и эффективность у госпитализированных взрослых не доказаны [2, 17]. В частности, следует соблюдать осторожность при назначении пробиотиков пациентам с ослабленным иммунитетом или при нарушениях целостности слизистой оболочки кишечника [11, 28]. У этих больных повышен риск транслокации пробиотических организмов из кишечника, а в редких случаях описаны случаи бактериемии, фунгемии, повышения летальности [28]. Эти данные требуют дальнейшего изучения.

Резюме и направления будущих исследований

ВБД является распространенным и недооцениваемым осложнением госпитализации, как правило, не связанным с ИСД. Этиология большинства случаев неинфекционная; на удивление мало известно о других причинах ВБД, особенно у пациентов в отделениях интенсивной терапии, трансплантации и онкологических. Лекарства вызывают большинство случаев диарей вследствие побочных эффектов, токсичности и нарушения микробиоценоза кишечника, которые в будущем можно будет смягчить путем изменений в лечении, с помощью пребиотиков и пробиотиков. Настоятельно необходимы систематические проспективные исследования по эпидемиологии и значению диареи у госпитализированных пациентов из групп высокого риска. В частности, следует изучить заболеваемость норовирусами и другими возможными инфекционными агентами. Открытым остается вопрос об изменениях микробиоценоза кишечника при госпитализации и роли кишечной микро­флоры в патогенезе диареи и возникновении осложнений.

Опубликованы руководства по диагностике и лечению ИСД [11], но не существует подобных рекомендаций для большинства других причин ВБД; необходима также стандартизация критериев диагностики, оценки тяжести и лечения подобных пациентов.