Журнал «Здоровье ребенка» 3 (46) 2013

Введение

Вторую группу NLR протеинов, участвующих в распознавании РАМР, представляют NLRB1/NAIP, NLRC4, NLRP1 и NLRP3, которые возбуждают ASC-ассоциированный сигнальный путь. NLRB1/NAIP и NLRC4, несмотря на структурные различия этих белков (молекула NLRC4 содержит CARD домен, а у NLRB1/NAIP в N-терминальном регионе находится три BIR домена), участвуют в рекогниции флагеллина, вызывая активацию прокаспазы-1 [23]. Установлено, что в ответ на провоспалительные стимулы адаптерный протеин ASC самостоятельно или с протеинами семейства NLR (NLRC4, NLRP1 и NLRP3) организует мультимолекулярные комплексы, получившие название «инфламмасомы», которые активируют каспазу-1, расщепляющую молекулярную проформу IL-1 [101].

Инфламмасомы

Впервые понятие «инфламмасома» появилось при изучении тонких механизмов активации про-IL-1F2/IL-1b и про-IL-1F4/IL-18. Fabio Martinon и соавт. [56, 57] под руководством Jürg Tschopp в 2002 году показали участие крупных мультимолекулярных комплексов NLR с молекулярной массой более чем 700 kDa в процессе аутокаталитического возбуждения каспазы-1. Протеины NLR способны в ответ на воздействие лигандов подобно молекуле APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) формировать специфические комплексы, похожие на «колесо смерти» APAF-1 (рис. 1). Мультимолекулярный комплекс, который сформирован гомотипическими CARD-CARD взаимодействиями между NLR и адаптерной молекулой ASC, назвали, по аналогии с апоптосомой, инфламмасомой. Под термином «инфламмасома» подразумевают цитоплазматические супрамолекулярные образования, которые формируются в макрофагах и дендритных клетках (DC) и служат платформой для рекрутирования и активации каспазы-1. Структура инфламмасомы состоит из трех структурно-функциональных компонентов — инициирующего, прокаспаза-1-активирующего и эффекторного [58]. Инфламмасомы рекрутируют молекулы каспазы-1, накапливая их на своей поверхности до критической концентрации, при которой возникают олигомеризация и аутокаталитическое возбуждение молекул каспазы-1 [4, 22, 58].

В настоящее время идентифицированы четыре типа инфламмасомы: NLRP1-инфламмасома, NLRP3-инфламмасома, NLRC4/IPAF-инфлам­масома и AIM2-инфламмасома, для которых определены молекулярная архитектура и физиологические функции (рис. 2) [32, 38, 49, 51, 55, 64]. Также высказывается предположение о возможности существования NLRP2-, NLRP6-, NLRP7- и NLRP12-инфламмасом [55, 72, 74].

Характеристика наличия экспрессии инфламмасом в различных тканях представлена в табл. 1.

NLRP1-инфламмасома

В организации NLRP1-инфламмасомы принимают участие протеин NLRP1 (NALP1; CARD7, CLR17.1, DEFCAP, NAC), адаптерная молекула ASC, каспаза-1 и каспаза-5. Молекула протеина NLRP1 состоит из 1473 аминокислотных остатков и содержит N-терминальный PYD, центрально расположенный NBD и C-терминальный домен с мотивами LRR. В отличие от других NLRP у молекулы NLRP1 отмечается удлинение C-домена за счет мотивов FIIND и CARD [56].

Для NLRP1-инфламмасомы в настоящее время идентифицировано два индуктора — летальный токсин сибирской язвы и MDP. Димерная молекула летального токсина сибирской язвы состоит из субъединицы пороформирующего протективного антигена (pore-forming protective antigen — PA) и металлопротеазной субъединицы летального фактора (lethal factor — LF). Субъединица РА обеспечивает проникновение в цитоплазму LF [53]. За восприимчивость LF отвечает один из трех парагенов NLRP1a, NLRP1b и NLRP1c — NLRP1b [12]. Проникновение субъединицы LF в цитоплазму макрофагов вызывает NLRP1-опосредованную летальную для клетки активацию каспазы-1 [31].

MDP, взаимодействуя с протеином NLRP1, вызывает конформационное изменение молекулы, которое активирует самоолигомеризацию NLRP1 и позволяет ему связываться с рибонуклеотидтрифосфатами [12, 60]. В неактивированных клетках протеин NLRP1 находится во взаимосвязи с антиапоптотическими белками Bcl-2 и Bcl-X (L), которые ингибируют процесс его олигомеризации. При активации макрофагов протеин NLRP1 освобождается от инактивирующей связи с Bcl-2 и Bcl-X (L) и приобретает способность взаимодействовать со своими лигандами, формируя инфламмасому. Гиперэкспрессия Bcl-2 сопровождается дефицитным возбуждением каспазы-1 и редуцированной продукцией IL-1F2/IL-1b [72, 79]. Одним из первых идентифицированных внутриклеточных партнеров протеина NLRP1 является адаптерная молекула ASC, с которой NLRP1 связывается через PYD-PYD взаимодействие [57]. Другим молекулярным партнером, с которым взаимодействует молекула NLRP1, является адаптерный протеин CARDINAL. Образовавшийся макромолекуляный комплекс NLRP1/ASC/CARDINAL рекрутирует и активирует каспазу-1 и каспазу-5 (рис. 3) [51].

В организации NLRP1-инфламмасомы может принимать участие протеин NLRC2/NOD2. Расположенный N-терминально эффекторный CARD-домен позволяет белку NLRC2/NOD2 участвовать в гомо- и гетеронимных CARD-CARD межмолекулярных взаимодействиях с протеинами, которые предопределяют развитие воспалительного и апоптотического процессов. Центральное положение в молекуле NLRC2/NOD2 занимает крупный нуклеотид-связывающий домен (NOD), отвечающий за олигомеризацию молекулы. На карбоксильном конце молекулы NLRC2/NOD2 находятся, в отличие от других представителей семейства NLR, два одинаковых LRR-домена, пространственное строение которых внешне напоминает соленоид. LRR-домен регулирует активность CARD-доменов и необходим для активации фактора транскрипции NF-kB. Прямая функция этого домена состоит в детекции и рекогниции определенных бактериальных молекулярных структур [44, 71].

NLRP3-инфламмасома

NLRP3-инфламмасома — наиболее изученная инфламмасома, которая ответственна за активацию каспазы-1. Она инициирует развитие воспаления в ответ на воздействие как РАМР инфекционных агентов, так и DAMP [18, 42, 58, 64].

Молекула NLRP3 (криопирин, CIAS1, CLR1.1 (Caterpiller protein 1.1), NALP3, PYPAF1), состоящая из 1036 аминокислотных остатков, содержит N-терминальный PYD, центральные NACHT-NAD и 7 повторов LRR в С-терминальном регионе. Так же, как NLRP1, протеин NLRP3 через PYD-PYD взаимодействия связывается с адаптерной молекулой ASC [49, 98]. Ген протеина NLRP3 первично был идентифицирован у больных с аутовоспалительными наследственными заболеваниями [17, 36].

Экспрессия протеина NLRP3 ограничена моноцитами, DC, Т-, В-лимфоцитами, эпителиоцитами, остеобластами и хондроцитами [17]. Большинство лигандов вызывают олигомеризацию NLRP3 только при участии АТФ или дезоксиАТФ. Исключение составляют бактериальная РНК и синтетические имидазоквинолиноподобные вещества R837 или R848, которые способны самостоятельно вызвать организацию NLRP3-инфламмасомы [8, 66]. Олигомеризация протеина NLRP3 ингибируется высокой внутриклеточной концентрацией ионов K⁺ [3].

Образование NLRP3-инфламмасомы инициируют живые бактерии (Klebsiella pneumonia, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Mycobacterium marinum, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes), вирусы (вирусы Сендая, гриппа и аденовирусы) и грибы (C.albicans). Однако остаются неизвестными механизмы рекогниции ДНК и РНК патогенных микроорганизмов: протеин NLRP3 непосредственно или при помощи неидентифицированных сенсоров обнаруживает инородные нуклеиновые кислоты [21, 43, 86, 90]. Напротив, Mycobacterium tuberculosis могут через систему ESX-1 секреции индуцировать возбуждение NLPR3-инфламмасомы [27] и, продуцируя Zn²⁺ металлопротеазу, ингибировать активность NLPR3-инфламмасомы [63, 74]. Однако уровень активности NLRP3-инфламмасомы не влияет на скорость саногенеза при туберкулезной инфекции [97]. Согласно замечанию Mohamed Lamkanfi и Thirumala-Devi Kanneganti [50], такие патогенные инфекционные агенты, как Salmonella typhimurium, Legionella  pneumophila, Pseudomonasa eruginosa, Shigella flexneri и Francisella tularensis, могут вызывать активацию каспазы-1 без участия NLRP3-инфламмасомы. Показано, что бактерии Klebsiella Pneumonia, Chlamydia и Neisseria gonorrhoeae активируют NLPR3-инфламмасому, обусловливая не только индукцию каспазы-1, но и высвобождение макрофагами и эпителиоцитами протеина HMGB1, который, попадая во внеклеточное пространство, взаимодействует с рецептором RAGE макрофагов и вызывает мощную продукцию TNF-a, усиливая воспалительный ответ [67, 70]. NLRP3-инфламмасома играет особенно важную роль в развитии воспалительного процесса при гриппозной инфекции [90, 91].

До недавнего времени считали, что триггерами NLRP3-инфламмасомы также являются РАМР (MDP, бактериальная РНК, LPS, Pam2CysK4, poly (I : C), зимозан), участвующие в индукции TLR-зависимого воспаления [39]. Однако в одном из исследований Luigi Franchi и соавт. [41] показали, что агонисты TLR не в состоянии непосредственно активировать формирование NLRP3-инфламмасомы, но TLR-ассоциированные сигнальные пути, возбуждая фактор транскрипции NF-kB, могут индуцировать экспрессию каспазы-1.

В настоящее время триггерными факторами NLRP3-инфламмасомы признаны поро­образующие бактериальные токсины (a-токсин, b- и g-гемолизин Staphylococcus aureus, нигерицин Streptomyces hygroscopicus, стрептолизин О Streptococcus pyogenes, листериолизин O Listeria monocytogenes, аэролизин Aeromonas hydrophila, майтотоксин Gambierdiscus toxicus), эндогенные стрессовые сигналы, DAMP (повышение концентрации АТФ, кристаллы эндогенных молекул, в частности натриевой соли мочевой кислоты, дигидрат пирофосфата кальция), агрегаты из эндомолекул (агрегаты b-амилоида, кристаллы холестерина), экзогенные ирританты (микрочастицы асбеста, кремния), компоненты вакцин (фосфат и гидроокись алюминия, полилактиды, полигликолиды, полистирен), ультрафиолетовое облучение [8, 16, 20, 37, 64].

Широкий диапазон лигандов NLRP3-инфламмасомы, по мнению Adam Williams и соавт. [101] и Courtney Wilkins, Michael Gale [100], резко снижает вероятность существования механизмов непосредственной рекогниции каждого триггерного фактора. Вероятнее всего, формирование NLRP3-инфламмасомы связано с индукцией общих внутриклеточных путей возбуждения. Основными кандидатами в индукторы NLRP3-инфламмасомы являются: снижение внутриклеточной концентрации ионов K⁺, высвобождение лизосомальных ферментов и активные кислородсодержащие метаболиты (АКМ).

Снижение внутриклеточной концентрации ионов K⁺, активирующее NLRP3-инфламмасому, опосредовано действием порообразующих бактериальных токсинов и возбуждением АТФ-P2X7R-паннексин-1 сигнального пути возбуждения [7, 41].

Порообразующие токсины, в частности нигерицин, способствуют не только снижению уровня ионов К⁺ во внутриклеточном пространстве, но и высвобождению катепсина В из лизосом [35].

Высвобождение ионов K⁺ клеткой непосредственно связано с действием внеклеточно расположенной ATФ, которая вызывает взаимодействие пуринергического рецептора P2X7 с паннексином-1 [46, 73, 76]. Пуринергические рецепторы представлены тремя семействами: аденозиновыми рецепторами (P1), ATФ-зависимыми катионными каналами (P2X) и G-протеиновыми рецепторами (P2Y). Тримерные рецепторы P2X классифицированы на 7 подтипов. Известно, что P2X рецепторы играют важнейшую роль в синаптической трансмиссии сигнала, вкусовых ощущениях, контроле тонуса гладкомышечных клеток. Подтипы P2X4 и P2X7 участвуют в работе ноцицептивной системы и провоспалительных механизмов [103]. Ген P2X7R расположен в хромосоме 12 (12q24) и кодирует длинный полипептид, состоящий из 595 аминокислотных остатков, которые организуют два трансмембранных участка, большой внеклеточный домен и внутриклеточные короткий N- и длинный C-конец (244 аминокислотных остатка). Экстрацеллюлярная область P2X7R содержит неканонический АТФ-связывающий сайт, внутриклеточный C-терминальный регион участвует во взаимодействии с LPS [28].

Уровень экспрессии P2X7 зависит от типа клеток. Так, активность экспрессии рецепторов P2X7 человеческими моноцитами практически в 5 раз выше, чем экспрессия лимфоцитами. Пролонгированная активность рецепторов P2X7 макрофагов сопровождается высвобождением IL-1F2/IL-1b, активацией NLRP3-инфламмасомы и формированием апоптосомы. Возбуждение рецепторов P2X7 связано с действием высоких микромолярных экстрацеллюлярных концентраций АТФ [19, 24, 28, 76, 77], паннексин-1 вместе с иннексинами и коннексинами представляет одно филогенетическое молекулярное семейство и является мембранным P2X7R-взаимодействующим протеином, который при активации образует в цитоплазматической мембране большую пору, способную пропускать катионоактивные, анионные молекулы с молекулярной массой до 800–900 Da, и в том числе ионы К⁺ [75]. Вторым важнейшим индуктором P2X7R-паннексина-1 взаимодействий является антимикробный пептид кателицидин (LL-37), который продуцируется в ответ на действие PAMP. По мнению Mark D. Wewers и Anasuya Sarkar [99], катионоактивный амфифильный пептид LL-37 приводит к высвобождению внутриклеточных ионов К⁺ при помощи трех механизмов: 1) самостоятельно образовывая мембранную пору; 2) непосредственно фосфорилируя тирозиновый остаток P2X7R, что предопределяет взаимодействие P2X7R с паннексином-1, который образует мембранную пору; 3) активируя P2X7R при образовании LL-37-пор (рис. 4).

Pablo Pelegrin [75] считает, что через паннексиновую пору во внутриклеточное пространство могут проникать PAMP, внеклеточно расположенные молекулы АТФ, индуцируя возбуждение NLR.

Установлено, что активность P2X7R ингибирует эрбстатин, синтетическим аналогом которого является AG126 [99].

Генерация активных кислородсодержащих метаболитов, которая может быть индуцирована различными РАМР, порообразующими токсинами, микрокристаллизованными молекулярными структурами, АТФ, высвобождением ионов K⁺ из цитоплазмы клетки, приводит к усилению деятельности NLRP3-инфламмасомы (рис. 5) [95].

АКМ реализуют свое действие, индуцирующее инфламмасомы, посредством различных механизмов. Они ингибируют активность молекул, стабилизирующих протеин NLRP3; способствуют генерации активирующих молекул; предопределяют высвобождение лизосомальных энзимов в цитоплазму клетки, вызывая нарушение целостности мембраны фаголизосомы, что приводит к расщеплению протеина, стабилизирующего молекулу NLRP3, или к активации эндогенных лигандов (рис. 6) [84, 101].

Однако самостоятельного влияния АКМ недостаточно для индукции формирования NLRP3-инфламмасомы, а гипергенерация АКМ инактивирует каспазу-1 [101].

Активация NLRP3-инфламмасомы при некоторых обстоятельствах является важнейшим компонентом репарации ткани, в частности при гриппозной инфекции для репаративных процессов легочной ткани требуется возбуждение NLRP3-инфламмасомы.

Процесс возбуждения NLRP3-инфламмасомы представляет достаточно сложный и неоднозначный процесс, развитие которого требует дальнейшего изучения. В настоящее время существует несколько гипотез, объясняющих механизмы активации NLRP3-инфламмасомы. Adam Williams и соавт. [101] полагают, что в физиологических условиях в клетках существует достаточно выраженная экспрессия ASC и каспазы-1 при низком уровне экспрессии NLRP3 и про-IL-1F2/IL-1b. Для активации NLRP3-инфламмасомы требуются два сигнала. Во-первых, необходимо возбуждение TLR или рецепторов провоспалительных цитокинов (сигнал 1), которое приводит к активации фактора транскрипции NF-kB, усиливает продукцию NLRP3 и pro-IL-1b, пребывающих в неактивной форме (фаза лицензирования инфламмасомы); во-вторых, воздействие эндогенных триггерных стимулов DAMP, АТФ, пороформирующих токсинов, кристаллов и др. (сигнал 2), которое обусловливает формированиеNLRP3-инфламмасомы (рис. 7).

Однако Veit Hornung, Eicke Latz [37], анализируя данные исследований, посвященных активации NLRP3-инфламмасомы при воздействии на клетку LPS и АТФ, сделали вывод о том, что в условиях гиперэкспрессии протеина NLRP3, вызванной не только мутациями гена NLRP3, для возбуждения NLRP3-инфламмасомы не требуется предварительный сигнал 1.

По всей вероятности, индукция механизмов, активирующих NLRP3-инфламмасому, в различных типах клеток имеет свои особенности. Так, например, показано, что активация NLRP3-инфламмасомы в моноцитах, макрофагах или DC отличается по крайней мере двумя фундаментальными признаками — характером активности каспазы-1 и наличием высвобождения эндогенной АТФ. По мнению Gang Chen и Joao H.F. Pedra [15], моноцитам присущи конститутивная активность каспазы-1 и наличие возможности высвобождения эндогенной АТФ, а в макрофагах и DC активация каспазы-1 всегда носит индуцибельный характер, и данные клетки не способны к высвобождению эндогенной АТФ во внеклеточное пространство. Поэтому моноцитам для активации каспазы-1 достаточно одного сигнала, возбуждающего образрас­познающий рецептор, а для макрофагов и DC необходимы два сигнала, один из которых приводит к усилению синтеза проформ интерлейкинов семейства 1, а второй — к активации каспазы-1, преобразующей проинтерлейкины семейства 1 в активные секретируемые формы (рис. 8).

Повышенная наследственно предопределенная или приобретенная возбудимость NLRP3-инфламмасомы приводит к развитию аутовоспалительного процесса [37].