Журнал «Здоровье ребенка» 2 (45) 2013

В течение долгого времени аллергические заболевания рассматривались в первую очередь как иммунологическая патология. Как следствие, развитие медикаментозной терапии было ориентировано на изменение Th2­эффекторной фазы. В последнее десятилетие наблюдается значительное изменение в понимании патогенеза, в частности, были получены убедительные данные о значении нарушения кожного барьера для развития чувствительности к аллергенам (Cork J. и др., 2009).

Главной гипотезой является то, что нарушение эпидермального барьера позволяет антигенпрезентирующим клеткам, таким как клетки Лангерганса (LC) или дендритные клетки (DC), связывать антигены окружающей среды. Кроме того, кератиноциты нарушенного барьера выделяют иммунные адъюванты, активирующие созревание LC и DС, а также влияют на их способность направлять поляризацию наивных Th­клеток и влиять на характер Th­ответа (De Benedetto A. и др., 2012).

В атопической коже было обнаружено нарушение созревания и транспортировки пластинчатых гранул. Это приводит к значительному дефициту кислот, липидов и ферментов в составе рогового слоя (SC), в результате — к дефекту барьерной функции кожи. Во время терминальной дифференциации кератиноциты своей плазматической мембраной образуют нерастворимый слой белка. Роговой слой состоит в основном из структурных белков, которые перекрестно связаны друг с другом действием трансглутаминаз. Эти ключевые структурные белки верхнего слоя эпидермиса, участвующие в ороговении, закодированы на хромосоме 1q21, в комплексе эпидермальной дифференциации (EDC). Именно в этом локусе найден ген, кодирующий филаггрин (Cork J. и др., 2009).

Термин «филаггрин» (производное от filament aggregating protein) был впервые введен в 1981 году для описания класса структурных белков, которые были изолированы из рогового слоя. Филаггрин специфически взаимодействует с промежуточными филаментами, в частности с кератинами. С другими компонентами цитоскелета, такими как актин и микротрубочки, филаггрин не взаимодействует (Sandilands A. и др., 2009).

Предшественник филаггрина — профилаггрин — большой (> 400 kDa) нерастворимый полипротеин, который в результате дефосфорилирования и деградирования образует мономеры филаггрина в роговом слое кожи. Далее филаггрин протеолизируется с образованием аминокислот. Каждый из этих компонентов вносит свой вклад в структуру и барьерную функцию эпидермиса, но точные механизмы, за счет которых при участии профилаггрина и филаггрина образуются дефекты кожного барьера, еще предстоит определить. Профилаггрин представляет собой основной компонент кератогиалиновых гранул, которые видны при световой микроскопии в зернистом слое эпидермиса. Молекула профилаггрина состоит из N­терминального домена, имеющего кальцийсвязывающий и ядерной локализации компоненты. После них следуют 10, 11 или 12 почти идентичных повторов филаггрина, с кератинсвязывающими свойствами, а также С­терминальный домен. Каждый из этих компонентов имеет различные функции в дифференциации эпидермиса.

N­терминальный домен профилаггрина человека составляет 293 аминокислоты в длину и может быть разделен на две подобласти: А­домен (81 аминокислота) и B­домен (212 аминокислот). А­домен содержит два Ca²⁺­связывающих фрагмента, наличие этих фрагментов предполагает, что Ca²⁺ является ключевым регулятором процессинга профилаггрина во время терминальной дифференцировки эпидермиса, более того, профилаггрин (но не филаггрин) связывается с кальцием. In vitro отщепление Ca²⁺ от профилаггрина индуцирует конформационные изменения. Такие Ca²⁺­зависимые конформационные изменения обеспечивают механизмы, действующие на сайты расщепления, инициируя тем самым процессинг.

 При использовании антител, специфических против А­ и В­доменов, было обнаружено, что обе области локализованы строго в кератогиалиновых гранулах. Это указывает, что домены являются неотъемлемой частью предшественника профилаггрина. Тем не менее во время процессинга профилаггрина в мономеры филаггрина А­ и B­домены отщепляются как отдельные фрагменты массой 32 кДа. Было высказано предположение, что N­терминальный домен играет важную роль в денуклеации кератиноцитов. Апоптоз ядер в кератиноцитах приводит к дегрануляции ороговевших клеток, которые положительно реагируют с антителами, специфичными для N­терминального домена. Таким образом, роль N­терминального домена заключается в Са²⁺­зависимой регуляции процессинга профилаггрина и в окончательной денуклеации кератиноцитов.

С­терминальный домен профилаггрина человека включает 157 аминокислот. Точная функция С­терминального домена неясна, но его экспрессия, по­видимому, необходима для процессинга профилаггрина в филаггрин. У людей с мутациями, которые приводят к экспрессии до 10 повторов филаггрина без С­терминального домена, не происходит процессинг профилаггрина. Мутации с потерей функции в экзоне 3 FLG приводят к усечению молекулы профилаггрина с недостачей С­конца, в результате чего происходит полное отсутствие мономеров филаггрина. Все известные FLG­нулевые мутации имеют эквивалентные молекулярно­биологические эффекты, так как каждая из них приводит к биохимической неустойчивости и усечению профилаггрина, не способного распадаться на функциональный филаггрин (Brown S.J. и др., 2012).

Профилаггрин подвергается обширному фосфорилированию после его синтеза. Этот процесс предотвращает его преждевременное связывание с нитями кератина, так как только дефосфорилированные мономеры филаггрина имеют свойства агрегации нитей кератина. Кластеры фосфорилированных аминокислотных остатков были определены в пределах каждого повтора филаггрина (около 17–20 фосфатов за повтор), а также в связующих регионах последовательности. Конформационные изменения в структуре белка, индуцированного фосфорилированием, могут сделать протеолитическое расщепление сайтов, таких как связывающие пептиды, недоступным для протеаз и, следовательно, могут защитить от преждевременного процессинга профилаггрина. Казеинкиназа­2 (КК2) является единственной протеинкиназой, которая фосфорилирует филаггрин in vitro. Тем не менее сама эта киназа не может в естественных условиях охватить все фосфорилирование профилаггрина. Анализ последовательности человеческого белка профилаггрина и сравнение с известными согласующимися последовательностями протеинкиназ указывают на наличие нескольких согласующихся протеинкиназ внутри каждого повтора (таких как КК2­целевых сайтов), а также в связывающих регионах и N­терминальном домене.

КK1, КК2 и GSK3 (киназа гликоген­синтаза 3), как правило, рассматриваются как постоянно активные протеинкиназы, так как их деятельность является относительно высокой в нестимулированных клетках, кроме того, они хорошо подходят для неспецифического фосфорилирования белков. Кроме того, в седьмом повторе филаггрина имеется AGC­киназный сайт (протеинкиназы A, G, C); в N­терминальном домене — CDK5, Akt (семейство протеинкиназ CAMK). Эти сайты в меньшей степени участвуют в предотвращении протеолиза, но, возможно, играют альтернативную роль в регуляции профилаггрина. Наконец, есть ряд сайтов тирозинкиназ, которые действуют на всю последовательность профилаггрина, в том числе в связующих областях, однако эти сайты имеют относительно низкое сходство последовательностей, и нет доказательств того, что фосфотирозин присутствует в профилаггрине. Таким образом, фосфорилирование играет важную роль в посттрансляционной обработке профилаггрина.

Протеолитические преобразования профилаггрина в мономерный филаггрин — сложный многоэтапный процесс, который включает в себя дефосфорилирование одной или несколькими фосфатазами и сайт­специфический протеолиз. Разумно предположить, что дефосфорилирование профилаггрина происходит в результате индукции активности белка фосфатазы (PPase), а не угнетения деятельности протеинкиназ, которые участвуют в фосфорилировании.

Во время финальной стадии терминальной дифференцировки несколько ключевых эпидермальных белков, таких как филаггрин, кератин­1 и трихогиалин, проходят деиминацию — посттрансляционное преобразование остатков аргинина в остатки цитруллина, которые катализируются пептидиларгининдеаминазой (PAD). Изоформы PAD — PAD1 и PAD3 в естественных условиях находятся рядом с филаггрином в зернистом и роговом слоях. Предполагается, что обе изоформы участвуют в де­аминации филаггрина. Деаминация филаггрина в пределах рогового слоя изменяет суммарный заряд филаггрина от начального до почти нейтрального, что нарушает ионные взаимодействия филаггрин­кератиновой связи.

Разворачивание филаггрина подвергает его дальнейшему протеолизу и способствует его деградации до свободных аминокислот. Обнаружено, что деаминированные мономеры филаггрина являются прямой мишенью для действия аспартат­протеазы каспазы­14. У мышей с дефицитом каспазы­14 было обнаружено чрезмерное накопление фрагментов филаггрина с низкой молекулярной массой (12–15 кДа) в пределах рогового слоя. Фенотипически эти мыши имели пониженный уровень увлажненности кожи, повышенную чувствительность к УФ и увеличение трансэпидермальной потери воды (TEWL). Хотя морфология кератогиалиновых гранул у мышей с дефицитом каспазы­14 была нарушена, процессинг профилаггрина не был изменен. Следовательно, каспаза­14 не имеет значения в начальном протеолитическом расщеплении профилаггрина, но участвует в дальнейшем освобождении мономеров филаггрина. Каспаза­14 может быть непосредственно вовлечена в протеолитическое расщепление мономера филаггрина или может действовать через активацию других промежуточных эндо­ или экзопептидаз. Филаггрин подвергается последовательной деградации под действием калпаина­1 и блеомицин­гидролазы (BH) (Denecker и др., 2008).

Описаны несколько факторов, которые играют важную роль в регуляции экспрессии филаггрина. Например, ранние исследования показали, что связывание транскрипционными факторами семейства AP1 (Jun и/или Fos) для чувствительных элементов в проксимальном промоутере FLG имеет важное значение для поддержания высокого уровня экспрессии профилаггрина. Кроме того, белки POU­домена (факторы транскрипции, которые содержат двудольный ДНК­связывающий домен, известный как POU­домен), выраженные в эпидермисе, такие как Oct1, Skn1a/і и Oct6, связывают in vitro до двух специфических опознавательных элементов в FLG­промоутере и стимулируют Jun­зависимую активность промоутера либо противодействуют ей.

Транскрипционный фактор р63 является необходимым для развития эпидермиса и существует в виде нескольких изоформ, которые возникают в результате использования альтернативного промоутера. Эти изоформы выражаются различно во время дифференцировки кератиноцитов. Трансактивирующая (TA) доменсодержащая изоформа p63 (TAp63a и TAp63g) блокирует FLG­транскрипцию, но не имеет никакого влияния на индукцию дифференцировки маркеров кератина­1 и кератина­10, что свидетельствует о специфическом действии этих изоформ на экспрессию профилаггрина. Подобным образом a­хвост N­терминально усеченной изоформы DNp63a также блокирует экспрессию профилаггрина, в то время как p63 изоформа DNp63p40, которая не содержит a­хвоста DNp63a, пропускает экспрессию полной панели эпидермальных маркеров дифференциации, в том числе профилаггрина. Это подтверждает мнение, что изоформа p63 работает в тандеме эпидермальной дифференциации. Промоутер FLG также содержит ретиноевую кислоту и элементы ответа на глюкокортикоиды, функционирующие для подавления активности промоутера в присутствии их лигандов (King и др., 2006).

Регуляция экспрессии филаггрина включает семейство пероксисом­пролифератор­активированных рецепторов (PPAR). PPARs являются лиганд­активированными факторами транскрипции с разнообразными функциями, которые включают активацию эпидермальной дифференциации. Таким образом, механизмы, лежащие в основе экспрессии филаггрина, остаются плохо понятыми, однако описанные выше результаты показывают, что комплексная регуляция деятельности FLG­промоутера в течение эпидермальной дифференциации является очень сложной и включает в себя тонко сбалансированное взаимодействие множества факторов транскрипции.

Барьерная функция обеспечивается агрегацией кератиновых волокон вне клетки, образуя роговой слой. Мономерный филаггрин связывается с кератином­1 и ­10 и другими промежуточными белками — филаментами кератинового цитоскелета, образуя тесные связи, таким образом, происходит коллапс и уплощение клеток на поверхности рогового слоя с образованием чешуек. До сих пор считается, что этот процесс клеточного уплощения происходит до процессинга филаггрина. На ультраструктурном уровне при наличии дефектов в FLG обнаружена дезорганизация нитей кератина и нарушение нормальной архитектуры пластинчатого бислоя кожи (Gruber и др., 2011). Снижение плотности рогового слоя и экспрессии белков, обеспечивающих эту плотность, наблюдается также в коже у пациентов с ихтиозом.

Филаггрин играет важную роль в белково­липидной структуре рогового слоя, который заменяет плазматическую мембрану дифференцированных кератиноцитов, образуя барьер, препятствующий потерям воды и минимизирующий попадание аллергенов и микроорганизмов. Было обнаружено, что протеолитическая активность клещей домашней пыли и аллергены тараканов повышают проницаемость барьера и активируют PAR2. Это приводит к увеличению проникновения аллергенов и зуду. Уровень специфического IgE к аллергенам клещей домашней пыли достоверно коррелирует с показателями при оценке по шкале SCORAD у пациентов с дефектами барьера кожи при атопическом дерматите (АД) (наличие мутации в гене FLG). Это отображает способность таких аллергенов усугублять AД, однако отсутствие корреляции у пациентов с AД без FLG­мутации с потерей функции указывает, что предрасположенность к наличию дефектного барьера необходима. Кроме того, был обнаружен более высокий процент положительных проб с клещами домашней пыли у пациентов с АД по сравнению с группой контроля. Это означает, что неповрежденный барьер защищает от проникновения аллергенов; кроме того, они могут выступать вторичными факторами, усугубляющими поражение кожи.

В конечном счете филаггрин деградирует на поверхности кожи с высвобождением его компонентов — аминокислот. Смесь гигроскопичных аминокислот концентрацией 100 ммоль образует так называемый естественный увлажняющий фактор (NMF), способствующий гидратации эпидермиса и осуществлению его барьерной функции. Филаггрин содержит большое количество гистидина, который метаболизируется в трансуроканиновую кислоту (транс­UCA) и пирролидон­5­карбоновую кислоту (РСА); эти органические кислоты помогают поддерживать градиент рН эпидермиса, о чем свидетельствует более высокий поверхностный рН у носителей нулевой мутации в FLG (Jungersted и др., 2010).

Кислоты рогового слоя имеют значительный антимикробный эффект. Есть свидетельства того, что продукты распада филаггрина при физиологической их концентрации оказывают угнетающее действие на рост S.aureus. Золотистый стафилококк может играть важную роль в хронизации и тяжести AД благодаря высвобождению экзотоксинов, которые являются суперантигенами. Суперантигены, выделяемые S.aureus в коже при AД, дополнительно стимулируют производство кератиноцитами тимического стромального лимфопоэтина (Thymic stromal lymphopoietin — TSLP) и вызывают поликлональную активацию Т­клеток путем связывания непосредственно с b (vb) цепью Т­клеточных рецепторов, что приводит к увеличенному Th2­воспалительному ответу, к ухудшению AД и может способствовать системному Th2­ответу и респираторной аллергии. После обработки аллергенов клетками Лангерганса, антигенпрезентирующими клетками эпидермиса они мигрируют в лимфатические узлы и связываются наивными Т­клетками, приводя к системному Th2­иммунному ответу. В дополнение к своим иммунологическим эффектам эти токсины могут также непосредственно повреждать кожный барьер. Стафилококки продуцируют протеиназы, которые могут выводить из строя корнеодесмосомы с помощью механизмов, подобных КЛК­пептидазам. Кроме того, золотистый стафилококк выделяет сфингозиндеацилазу и глицерофосфолипиды, которые могут помешать образованию липидных пластинок эпидермиса.

Кислый рН в пределах рогового слоя также имеет важное значение для функциональной активности ферментов, участвующих в метаболизме церамидов. Также повышенная кислотность модулирует активность каскада сериновых протеаз, необходимых для скоординированной эпидермальный дифференциации и формирования клеток рогового слоя. Кроме того, существуют данные, демонстрирующие роль рН кожи в процессе шелушения, проницаемости барьера, гомеостаза и целостности SC. Для сериновых протеаз KLK5 и KLK7, участвующих в шелушении, оптимальное значение рН нейтральное. Изменение рН от 7,5 до 5,5 снижает активность KLK7 на 50 %. Активность ферментов in vivo находится под контролем рН­чувствительного ингибитора LEKTI. Для катепсина LZ и катепсина D оптимальный рН — кислый. Для липидообразующих ферментов, b­глюкоцереброзидазы и сфингомиелиназы также необходима низкая кислотность. При повышении рН кожи путем блокирования секреторной фосфолипазы A2 или натрий­протонной помпы могут возникать нарушения эпидермального барьера, которые корректируются воздействием ингибитора кислотного буфера. Кроме того, задержка восстановления эпидермального барьера происходит при погружении кожи в среду с нейтральным буфером. Следует отметить, что рН кожи значительно повышен у пациентов с АД по сравнению с группой контроля, даже на непораженной коже. Было показано, что значения рН кожи выше у пациентов с обширным поражением, чем у пациентов в бессимптомный период.

Также возможно участие продуктов филаггрина в защите от УФ­излучения. При фотоизомеризации трансцисуроканиновой кислоты образуются молекулы со спектром действия 280–310 нм, которые находятся в УФ­диапазоне. Іn vitro было обнаружено, что цис­UCA обладает иммуномодулирующим действием в кератиноцитах и лейкоцитах человека. Существуют также данные, полученные in vitro из органотипических миРНК FLG, что отсутствие филаггрина приводит к снижению концентрации уроканиновой кислоты и увеличению чувствительности кожи к УФ­индуцированному апоптозу.

Известно, что величина дефекта барьера при AД измеряется трансэпидермальной потерей воды (TEWL) на неповрежденных участках, которая коррелирует с тяжестью заболевания и значением IgE в сыворотке. С помощью этого физиологического показателя функции эпидермального барьера Boralevi и соавт. показали, что у младенцев с AД с двумя и более положительными патч­тестами значения TEWL были выше, чем у младенцев с одним или без положительного теста (Boralevi и др., 2008). Исследования (Flohr и др., 2010) показали, что мутации FLG были связаны с более высокой TEWL в клинически нормальной коже предплечья у 3­месячных младенцев вне зависимости от атопического статуса.

При исследовании атопического воспаления в коже на мышиных моделях у сенсибилизированных мышей утолщался эпидермис, возникала воспалительная инфильтрация CD4+ Т­клетками и эозинофилами, экспрессия Th2­цитокинов, умеренный рост IFN­g, Th2­хемокинов, таких как эотаксин и Th2­адъювант, TSLP, а также аллерген­специфический IgE. Кроме того, у этих мышей возникала гиперчувствительность дыхательных путей к метахолину с эозинофилией после однократной дозы ингаляции. Это показывает, что антигенное воздействие через поврежденную кожу является достаточным, чтобы вызвать системное (Th2) аллергическое воспаление в отдаленных органах, таких как нижние дыхательные пути и пищевод. Это может помочь объяснить так называемый «аллергический марш», где AД является самым ранним атопическим заболеванием. Кроме того, это подчеркивает важность кожной сенсибилизации аллергенами, даже если аллергическое воспаление происходит в отдаленных органах.

Чтобы продемонстрировать важность этого пути иммунизации, было исследовано, возникал ли иммунологический ответ, если аллерген (например, арахисовый белок) наносили на нарушенный эпидермис (в течение 24 часов) или вводили подкожно с адъювантом Фрейнда (CFA). При накожном пути генерируется Th2­иммунный ответ в лимфатических узлах и селезенке (повышение IL­4 и антиген­специфического IgE и снижение IFN, IL­10 и IgG2a), в отличие от подкожного пути, который вызывал Th1­иммунный ответ (повышение IFN­g IgG2a и снижение IL­4 и антиген­специфического IgE). Это не удивительно, поскольку CFА является Th1­ и, возможно, Th17­адъювантом, широко используемым во многих вакцинах. Более интересным было бы оценить адаптивный иммунный ответ на подкожное введение антигена с Th2­адъювантом. В последующей работе эта группа показала, что иммунизация в ответ на антиген, нанесенный на эпидермис с нарушенной целостностью, смогла переключить установленный Th1­ответ на Th2­ответ (De Benedetto A. и др., 2012).

Значительные ассоциации FLG нуль­мутаций с атопическим дерматитом были найдены в более чем 20 независимых исследованиях, в том числе в случай/контроль и семейных исследованиях. Два последних метаанализа этих данных оценили отношение шансов развития атопического дерматита: 4,78 (van den Oord и Sheikh, 2009) и 3,12 (Rodriguez и др., 2009) в ассоциации с FLG­нулевым генотипом. Атопический фенотип, который наиболее тесно связан с нулевыми FLG­мутациями, характеризуется ранним началом, тяжелыми и стойкими клиническими проявлениями с соответствующими высокими показателями общего IgE и аллергической сенсибилизацией. Популяционные когортные исследования атопического дерматита легкой и средней степени тяжести также продемонстрировали значимую связь с FLG нуль­мутациями (Gruber R. и др., 2011). Тем не менее при легком атопическом дерматите показано более низкое отношение шансов его связи с FLG нуль­мутациями, чем при тяжелом дерматите, и связь с FLG нуль­мутацией может быть значительной только у лиц, несущих две нулевые мутации. Принимая во внимание все клинические признаки, которые могут быть связаны с FLG­гаплонедостаточностью, можно сделать выводы, что FLG нуль­мутации довольно пенетрантны.

С момента открытия первых двух FLG­мутаций с потерей функции (R501X и 2282del4) в 2006 году, эти две мутации, наряду с менее распространенными S3247X и R2447X, были тщательно изучены. Они присутствуют у 7–10 % белого европейского населения. Впоследствии было обнаружено еще в общей сложности более 20 других редких FLG­мутаций с потерей функции в экзоне­3 в европейской популяции. Тем не менее эти мутации специфичны для одних популяций и не могут быть использованы для генетических эпидемиологических исследований в других. В случае филаггрина легко идентифицируемые причинные мутации показали сложную генетическую архитектуру этого локуса, где каждая популяция имеет свой собственный уникальный спектр мутаций, некоторые редкие и некоторые распространенные, которые находятся в различных гаплотипах поблизости SNP. Таким образом, отдельные SNP могут выявить только часть сигнала, поступающего от FLG­локуса, маскируя далее его значение в восприимчивости к атопии (Brown S.J. и др., 2012).

Дефекты в FLG являются важными факторами риска для каждого шага атопического марша: атопического дерматита, аллергической сенсибилизации, астмы с предыдущим атопическим дерматитом, аллергического ринита, а в последнее время аллергии на арахис. Таким образом, FLG­нулевые аллели являются существенным фактором риска для всех аспектов атопии, но с разными шансами для каждого конкретного фенотипа. Сосуществование FLG­мутаций и ранней пищевой аллергии имеет положительное прогностическое значение в развитии детской астмы. Это наблюдение было интерпретировано как представление двух различных механизмов, взаимодействующих в патогенезе астмы (Marenholz и др., 2009). Исследование дефектов в гене FLG указало на важную связь нарушенного кожного барьера с развитием астмы и аллергии. В первоначальном исследовании, которое показало связь между АД и FLG­мутациями, Palmer C.N. и др. (2006) также показали, что эти мутации были тесно связаны с астмой, но только у тех лиц, у которых был в анамнезе АД. Последующие исследования также подтвердили эту важную взаимосвязь (Weidinger S. и др., 2008). В настоящее время наиболее распространенным методом изучения генетических основ бронхиальной астмы является поиск ассоциаций заболевания с полиморфизмом кандидатных генов. Наличие полиморфизма может приводить к изменению уровня экспрессии данного гена и/или структуры его белкового продукта.

Таким образом, существует множество доказательств (клинические, генетические и экспериментальные исследования) в пользу предположения, что предшествующий AД является необходимым условием для развития аллергического ринита и бронхиальной астмы, причем в патогенезе этих нарушений важную роль играет повреждение эпидермального барьера. Терапия, ориентированная на восстановление эпидермального барьера у детей с АД, может предотвратить последующее развитие астмы. В настоящее время в ряде стран ведутся исследования относительно терапевтического потенциала эмолентов в улучшении эпидермального барьера. Также появляются экспериментальные данные, демонстрирующие, что FLG­ген поддается регуляции. Изучение различных функций профилаггрина, филаггрина и аминокислот важно для рассмотрения дальнейших стратегий восстановления или замены этих молекул в коже человека.