Журнал «Здоровье ребенка» 3 (38) 2012

Сокращения: CCL20/MIP-3a (macrophage inflam­matory protein-3a) — макрофагальный провоспалительный протеин 3a; CCL5/RANTES (regulated on activation normal T-cell expressed and secreted) — регулятор активности экспрессии и секреции нормальными Т-лимфоцитами; CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) — трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза; CNV (copy number variation) — вариации числа опий-генов; CXCL10/IP-10 (interferon-inducible protein 10) — интерферон-индуцируемый протеин 10; CXCL5/ЕNА-78 (epithelial neutrophil-activating peptide-78) — эпителиальный нейтрофил-активирующий пептид 78; DEFA (defensin, alpha) — ген a-дефензина; DEFB (defensin, beta) — ген b-дефензина; G-CSF (Granulocyte colony stimulating factor) — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; HBD (human b-defensins) — человеческий b-дефензин; HNP (human neutrophils peptide) — человеческий нейтрофильный пептид, нейтрофильный a-дефензин; HRV (human rhinovirus) — риновирус человека; LTB4 (leukotriene B4) — лейкотриен B4; MUC (mucin) — муцин; NF-B (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells) — ядерный фактор транскрипции каппа В; SNP (single-nucleotide polymorphism) — однонуклеотидные полиморфизмы генов; TNF (tumor necrosis factor) — фактор некроза опухоли.

Дефензины и заболевания респираторного тракта

Дефензин-ассоциированные заболевания

Вариации числа копий (CNV — copy number varia­tion) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP — single-nucleotide polymorphism) генов дефензиновых пептидов могут приводить к изменению уровня экспрессии или активности HNP и HBD [6, 246], увеличивая риск развития инфекционных, воспалительных, аутоиммунных и других заболеваний человека.

Вариации числа копий генов дефензиновых пептидов

Изменчивость генома человека характеризуется значительным разнообразием форм — от больших, микроскопически определяемых нарушений хромосом до однонуклеотидных замен в молекулярной последовательности ДНК. Начиная с 2004 года в многочисленных исследованиях были представлены данные о наличии множества субмикроскопических вариаций числа копий сегментов ДНК, размеры которых колеблются от килобаз (Кб) до нескольких мегабаз. Минимум 12 % человеческого генома подвергается вариациям числа копий. CNV — это сегменты ДНК размером от 1 Кб, число копий которых отличается друг от друга у разных индивидуумов [90]. В геноме каждого человека около 100 CNV длиной более 50 Кб. Вклад CNV в вариативность генома сопоставим с лептой однонуклеотидных полиморфизмов или даже превышает ее [7].

Локус дефензиновых генов на хромосоме 8 (8p23.1) является одним из самых вариабельных участков генома человека по числу генных копий [97, 107].

Изменение числа копий дефензиновых генов определяет восприимчивость к определенным инфекционным агентам [136] и риск развития рецидивирующих и хронических воспалительных заболеваний, в частности кожи [200], респираторного [88] и пищеварительного трактов [23], рака предстательной железы [87]. Wim Janssens и соавт. [88] показали, что наличие более 5 копий гена DEFB4 сопровождается повышенным риском развития хронического обструктивного заболевания легких. Проведенное исследование QiXing Chen и соавт. [136] позволило выявить высокую степень ассоциации наличия более 8 копий генов DEFB1, DEFA103 с развитием тяжелого септического процесса. Представляет интерес то, что у пациентов китайского происхождения с тяжелым течением септического процесса и большим числом (более 8) копий генов DEFB1, DEFA103 наблюдалось более низкое содержание данных пептидов и цитокинов (TNF-a, IL-6, IL-10) в сыворотке крови относительно больных, у которых было выявлено меньшее количество генных копий.

Однонуклеотидные полиморфизмы генов дефензиновых пептидов

В настоящее время установлены SNP генов дефензиновых пептидов, ассоциированные с муковисцидозом и бронхиальной астмой. Мутации гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (CFTR), несомненно, являются основным генетическим фактором, который определяет развитие заболевания. Тем не менее другие генетические факторы, такие как полиморфизмы генов, кодирующих дефензины, модифицируют течение инфекционно-воспалительного процесса респираторного тракта у больных с муковисцидозом. Riccardina Tesse и соавт. [21] показали, что колонизация Pseudomonas aeruginosa респираторного тракта у больных с муковисцидозом ассоциирована с полиморфизмами G-20A (rs11362), C-44G (rs1800972), G-52A (rs1799946) гена DEFB1. Авторы предположили, что пациенты с этими SNPs имеют более низкую экспрессию DEFB1 и, следовательно, повышенный риск колонизации Pseudomonas aeruginosa. Однако исследование, проведенное позже Sergio Crovella и соавт. [4] среди северо-восточной популяции больных, не выявило существенно значимого риска колонизации Pseudomonas aeruginosa респираторного тракта у больных с муковисцидозом, несущих данные SNP гена DEFB1. Детальное исследование гомозиготных пациентов с муковисцидозом позволило выявить ассоциацию мутации F508del гена CFTR с SNP G-20A (rs11362) в 5' промоторном регионе гена DEFB1 [4].

Однонуклеотидные полиморфизмы в 5' промоторном регионе (g. — 1816 T > C) и интроне (IVS + 692 G > A) гена DEFB1 несут достоверный риск развития бронхиальной астмы [22].

Патогенетическое значение дефензинов при заболеваниях респираторного тракта

В настоящее время существуют многочисленные доказательства участия дефензинов в процессах сано- и патогенеза широкого круга заболеваний.

При заболеваниях органов дыхания практически любого генеза дефензины играют если не ключевую, то далеко не последнюю роль.

Острые респираторные вирусные инфекции

В силу широкого спектра и выраженной противовирусной активности дефензиновых пептидов уровень их продукции предопределяет течение острых респираторных инфекций, вызванных вирусом гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальным вирусом, аденовирусом. Дефензины участвуют в саногенезе острых респираторных вирусных инфекций, снижая вирулентный потенциал возбудителя и модулируя иммунный ответ.

Грипп

Миелоидные дефензины, проявляя вирулицидную активность сразу после заражения человека, непосредственно инактивируют оболочечные вирусы, в том числе вирус гриппа A, что, вероятно, связано с их способностью дестабилизировать организацию вирусного капсида. Введение НNP-1 в клеточную культуру сразу после инфицирования вирусом гриппа достоверно ингибирует репликацию вируса. HNP-1, HNP-2, HNP-3 ингибируют активность вируса гриппа A, используя несколько механизмов. Во-первых, HNP непосредственно связываются с вирусами гриппа A. Во-вторых, они подавляют репликацию вируса за счет ингибиции активности протеинкиназы С (PKC) в инфицированных клетках [9]. HNP-1, HNP-2 и HD-5, но не HBD-2 и HBD-3 повышают активность поглощения вирусов гриппа A нейтрофилами. HNP также модулируют противогриппозное действие сурфактантного протеина D, усиливая его гемагглютинин-связывающую активность [58].

Медикаментозное ингибирование дефензин-опо­средованной противовирусной активности сыворотки крови существенно ухудшает прогноз гриппозной инфекции [42], а увеличение уровня концентрации a-дефензинов в жидкости носовой полости, вызванное интраназальным введением LTB4, сопровождается достоверным усилением противовирусной активности супернатантов по отношению к коронавирусу, респираторно-синцитиальному вирусу и вирусу гриппа B [166]. Исследования Tianxiang Gong и соавт. [204] показали, что превентивное введение и введение сразу после момента инфицирования вирусом гриппа A рекомбинантного mBD2 мышам предупреждает летальный исход заболевания в 70 и 30 % случаев соответственно.

Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция

По мнению Srikanth Kota и соавт. [210], при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции характерна TNF-индуцированная NF-B-зависимая экспрессия HBD-2 эпителиоцитами респираторного тракта (рис. 1). Вероятно, данный механизм индукции экспрессии дефензинов может быть патогенетически значимым при гриппозной и парагриппозной инфекциях.

Внеклеточно расположенные молекулы HBD-2 дезинтегрируют капсидную архитектуру респираторно-синцитиального вируса, изменяют форму вирионов, вследствие чего препятствуют проникновению вируса в клетку. Особое саногенетическое значение HBD-2 подчеркивается тем, что концентрация пептида, при которой он проявляет противовирусное действие, соответствует физиологическому уровню содержания в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Пептид HBD-2 действует на ранних стадиях инфекционного процесса, ограничивая диссеминацию вирусных агентов. Эндотрахеальное введение очищенного пептида HBD-2 резко останавливает развитие экспериментальной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. Учитывая, что респираторно-синцитиальный вирус нечувствителен или малочувствителен к действию IFN-a-индуцированных противовирусных протеинов, пептид HBD-2 представляет важнейший компонент неспецифических механизмов противовирусного ответа эпителиальных клеток респираторного тракта при острой инфекции, вызванной данным вирусом [210]. В саногенезе инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом, активное участие принимают и другие b-дефензины, в частности HBD-1 и HBD-3. Однако показано, что респираторно-синцитиальный вирус обладает способностью подавлять экспрессию HBD-3. Выраженная вирус-ассоциированная ингибиция экспрессии HBD-3 создает условия для колонизации Haemophilus influenzae в респираторном тракте и в полости среднего уха, увеличивая риск развития острого среднего отита [208].

Риновирусная инфекция

David Proud и соавт. [199] установили, что во время инфекции, вызванной различными серотипами риновирусов (HRV — human rhinovirus), увеличивается экспрессия HBD-2 и HBD-3 в эпителиальных клетках респираторного тракта. Увеличение количества мРНК HBD-2 коррелирует с титром вирусных агентов в промывных водах носовой полости. Несмотря на то, что риновирусы различных серотипов используют разные механизмы взаимодействия с клеткой и проникновения во внутриклеточное пространство, уровень продукции HBD-2 не зависит от серотипа риновирусов. Учитывая, что для риновируса не характерно выраженное цитопатическое действие на эпителиальные клетки респираторного тракта, его роль в развитии бронхиальной астмы и хронических бронхообструктивных заболеваний, вероятно, обусловлена способностью вируса модулировать цитокин- и хемокинпродуцирующую активность эпителиоцитов [89]. Так, при инфицировании риновирусом эпителиальные клетки человека в условиях in vitro продуцируют широкий спектр различных биологически активных веществ, в том числе хемокины (IL-8/CXCL8, CXCL5/ЕNА-78, CXCL10/IP-10, CCL5/RANTES), интерлейкины (IL-1, IL-6, IL-17A), дефензины (HBD-2 и HBD-3). Shahina Wiehler и David Proud [248] привели доказательства того, что при риновирусной инфекции вирус-индуцированная продукция IL-17A преимущественно определяет уровень экспрессии HBD-2.

Аденовирусная инфекция

Показано, что пептиды HNP-1, HNP-5 и HBD-3 даже при низких концентрациях ингибируют аденовирусную инфекцию [221]. HNP-1 при концентрации 50 мкг/мл подавляет уровень репликации аденовируса 5-го типа на 97 %, в то время как HBD-2 в той же концентрации обеспечивает ингибицию репликации вируса менее чем на 10 %. Также характерен различный уровень противовирусной активности дефензинов по отношению к различным серотипам аденовирусов. Например, противовирусное действие HNP-1 характеризуется высокой эффективностью по отношению к аденовирусам 3-го и 5-го типа, но практически неопределяемо против аденовирусов 8-го и 19-го типов [100].

Острые бактериальные воспалительные заболевания респираторного тракта

Во время острых воспалительных заболеваний и при обострении хронических болезней бронхопульмональной системы отмечается как местное, так и системное усиление экспрессии и продукции дефензинов.

Эпидемиологические исследования и экспериментальные модели показали, что b-дефензины играют важную роль в антибактериальной защите полости среднего уха. Учитывая то, что пептид HBD-1 обладает высокой бактерицидной активностью по отношению к Moraxella catarrhalis, HBD-2 — по отношению к Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenzae, то есть к возбудителям, которые занимают ведущее место в этиологической структуре данного заболевания, и способность эпителиальных клеток среднего уха к секреции HBD-1, HBD-2, HBD-3, предполагают, что снижение продукции b-дефензинов может быть ключевым фактором патогенеза среднего отита у детей [240].

При острых воспалительных заболеваниях бронхолегочной системы наблюдается повышение уровня концентрации HNP в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и в сыворотке крови [5].

Концентрация HNP в сыворотке крови у больных с острыми инфекционно-воспалительными заболеваниями бронхолегочной системы, особенно при развитии септических осложнений, может достигать очень высокого уровня. Так, общая концентрация миелоидных a-дефензинов в сыворотке крови во время септического процесса может быть выше, чем 170 мкг/мл [178, 190].

Takeaki Hiratsuka и соавт. [135] было показано, что у больных с диффузным бронхиолитом в острый период заболевания наблюдается достоверное повышение концентрации HBD-1, HBD-2 в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и HBD-2 в сыворотке крови (табл. 1). У пациентов с диффузным бронхиолитом концентрация HBD-2 коррелирует с количеством нейтрофилов и концентрацией IL-1b в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Авторами продемонстрировано снижение концентрации HBD-2 в жидкости бронхоальвеолярного лаважа к периоду реконвалесценции заболевания, которое происходит на фоне лечения макролидами.

Chiara Tirone и соавт. [40] установили, что у новорожденных детей во время пневмонии отмечается выраженное повышение концентрации HNP-1, HNP-2, HNP-3, HNP-4 в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Также у больных с пневмонией в острой фазе заболевания наблюдается повышение уровня концентрации HBD-2, HBD-3 до 32,1 ± 3,7 фемтомоль/мл, 239,4  17,8 пг/мл в сыворотке крови соответственно. К периоду реконвалесценции концентрация HBD-3 в сыворотке крови снижается до 159,3  20,1 пг/мл. В острый период пневмонии увеличивается и активность экспрессии HBD-3 в ткани легкого [127].

У больных с активным туберкулезом легких уровень концентрации миелоидных a-дефензинов может повышаться до 437 ± 38 нг/мл в сыворотке крови и до 1245 ± 314 нг/мл в жидкости бронхоальвеолярного лаважа [64].

Дефензины и другие противомикробные пептиды также играют определенную роль в развитии перитонзиллярных абсцессов, хронических риносинуситов [240].

Муковисцидоз

Течение муковисцидоза во многом зависит от наличия и степени колонизации респираторного тракта Pseudomonas aeruginosa. У пациентов с муковисцидозом средняя концентрация миелоидных a-дефензинов в мокроте составляет 400 мкг/мл, но иногда может превышать 1600 мкг/мл [222], а в слюне достигает 1 мг/мл [175]. Одним из самых загадочных феноменов муковисцидоза является сочетание высокого содержания нейтрофилов и концентрации их антимикробных пептидов в мокроте с устойчивой бактериальной колонизацией респираторного тракта [121]. Возможным объяснением данного противоречия может быть характерный для больных с муковисцидозом низкий уровень фагоцитарной активности у нейтрофилов и макрофагов респираторного тракта. Дефект фагоцитоза, определенно, связан с высокой концентрацией в бронхоальвеолярной жидкости пептидов HNP, которые ингибируют фагоцитирующие клетки [121].

Бронхиальная астма

Дефензины являются активными участниками развития бронхиальной астмы. Многими авторами подчеркнута особая роль дефензинов в патогенезе вирус-индуцированной бронхиальной астмы [198].

В настоящее время неоспоримо доказано участие вирусных респираторнотропных агентов в развитии бронхиальной астмы, в частности респираторно-синцитиального и риновируса [89]. Острые респираторные вирусные инфекции, вызванные данными вирусами, сопровождаются повышением экспрессии HNP, которые индуцируют продукцию IL-8/CXCL8 эпителиальными клетками. В свою очередь, повышение концентрации IL-8/CXCL8 обусловливает рекрутирование нейтрофилов к месту поражения респираторного тракта. Патогенетическое значение IL-8/CXCL8 характерно для вирус-индуцированной, но не атопической формы астмы. Так, у пациентов с вирус-индуцированной бронхиальной астмой количество IL-8/CXCL8-продуцирующих клеток достоверно выше, чем у лиц с атопической формой заболевания. Кроме того, IL-8/CXCL8 селективно ингибирует продукцию IL-4 и IgE [189]. Jeremy Hul и соавт. [241] установлено, что у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией, которая сопровождается развитием бронхиолита, достоверно чаще встречается SNP 251A в промоторном регионе гена IL-8, который сопровождается повышенной продукцией IL-8/CXCL8. Хемокин IL-8/CXCL8, взаимодействуя с рецепторами CXCR1 нейтрофилов и моноцитов, активирует механизмы их хемотаксиса. Важно отметить, что степень тяжести вирус-индуцированной бронхиальной астмы высоко коррелирует с представительством нейтрофилов в слизистой оболочке респираторного тракта [227].

Дефензин HBD-2 непосредственно и HBD-3, HBD-4 опосредованно, индуцируя продукцию CCL20/MIP-3a [18], рекрутируют в очаг воспаления Th17 клетки, продуцирующие IL-17. Несмотря на то, что IL-17, по всей вероятности, не индуцирует Th₂-ассоциируемую воспалительную реакцию, для больных с бронхиальной астмой в мокроте и жидкости бронхоальвеолярного лаважа характерна высокая концентрация мРНК и пептидов IL-17, уровень которой коррелирует со степенью тяжести гиперреактивности бронхов [130, 245]. IL-17 индуцирует экспрессию IL-6, IL-8/CXCL8, IL-11 и CXCL1/Gro-a фибробластами бронхов, HBD-2, ICAM-1, IL-8/CXCL8, CXCL1/Gro-a, CCL20, G-CSF, MUC5B и MUC5AC эпителиоцитами респираторного тракта, IL-6 и IL-8/CXCL8 гладкомышечными клетками бронхов (рис. 2) [183].

Кроме того, HBD-2, HBD-3, HBD-4 и IL-17 индуцируют продукцию CCL5/RANTES и CCL11/эотаксина, которые являются хемоаттрактантами для эозинофилов. Цитокин IL-17, нарушая кооперацию CD4⁺ Т-лимфоцитов и B-клеток, снижает уровень активности гуморального ответа. Таким образом, дефензины способствуют развитию как нейтрофильного, так и эозинофильного воспаления слизистой оболочки респираторного тракта [18, 130, 245]. В настоящее время различают атопическую и неатопическую формы бронхиальной астмы. Атопическая форма бронхиальной астмы характеризуется увеличением представительства клеток Th₂ в слизистой оболочке бронхов и повышенной концентрацией аллергенспецифических IgE в сыворотке крови. Неатопическая форма отличается увеличением представительства IL-8/CXCL8-продуцирующих клеток и нейтрофилов в слизистой оболочке бронхов без сопровождающего повышения концентрации IgE в сыворотке крови. Атопическая форма может быть представлена двумя вариантами: эозинофильным и неэозинофильным. Эозинофильный вариант бронхиальной астмы чувствителен к терапии кортикостероидами и характеризуется признаками Th₂-ассоциированного и эозинофильного воспаления, а неэозинофильный вариант бронхиальной астмы нечувствителен к терапии кортикостероидами и характеризуется признаками нейтрофильного воспаления (рис. 3) [183].

Учитывая спектр цитокинов, которые индуцируются под влиянием дефензинов, можно считать, что они принимают непосредственное участие в развитии бронхиальной астмы по не-Th₂-типу.

Пептиды HNP и некоторые b-дефензины (HBD-2, HBD-3, HBD-4) индуцируют тучные клетки, вызывая высвобождение гистамина и простагландина D₂ [16, 148, 179], что способствует развитию бронхообструкции.

Дефензин HNP-1 [61, 177] и IL-17 стимулирует экспрессию генов муцина, MUC5B и MUC5AC, эпителиоцитов респираторного тракта, вызывая гиперсекрецию слизи в бронхиальном дереве [187].

Заключение

Ведущими компонентами неспецифической защиты респираторного тракта являются антимикробные пептиды, среди которых дефензины представляют особое разнообразное молекулярное семейство катионоактивных эффекторов. Исходя из расчетов существования возможных генов, было сделано предположение, что у человека присутствует более ста дефензиновых пептидов. Человеческие дефензины представляют собой семейство амфифильных, катионных, богатых цистеиновыми остатками маленьких пептидов, молекула которых состоит всего из 29–47 аминокислотных остатков. Они защищают поверхности слизистых оболочек и кожных покровов от патогенных микроорганизмов и участвуют в регуляции жизнедеятельности эубиотической флоры и иммунной системы человека, тем самым предупреждая развитие инфекционных, воспалительных и аллергических заболеваний. Дефензины играют важную роль в саногенезе разнообразных болезней бронхолегочной системы — и острых респираторных вирусных, бактериальных инфекций респираторного тракта, и бронхиальной астмы. По всей вероятности, будущие исследования клинико-патогенетического значения семейства дефензинов в развитии патологии респираторного тракта откроют новые диагностические и прогностические маркеры неблагоприятного течения бронхолегочных заболеваний. Разработка терапевтических методов регуляции продукции дефензинов может стать решающим компонентом медикаментозного управления некоторыми дефензин-ассоциированными заболеваниями. В настоящее время представлены доказательства индуцирующего влияния пробиотических средств на экспрессию b-дефензинов энтероцитами толстого кишечника. Однако не проведено исследований о влиянии пробиотиков на продукцию дефензинов в респираторном тракте. Дефензины по праву считают эндогенными антибиотиками. На основе дефензинов, обладающих выраженными бактерицидными, вирулицидными и фунгицидными свойствами, сегодня ведущими фармакологическими фирмами уже созданы и активно производятся новые лекарственные средства, которые идут на смену антибиотикам, выработавшим свой потенциал, в связи с увеличением антибиотикорезистентности патогенных бактерий.