Журнал «Здоровье ребенка» 3 (38) 2012

Несмотря на достигнутые успехи в медицине, проблема гнойно-септических заболеваний у детей, таких как острая гнойно-деструктивная пневмония (ОГДП), перитонит, острый гематогенный остеомиелит (ОГО), остается крайне актуальной в связи с высокой частотой осложнений и летальностью [1, 2].

Частота случаев развития сепсиса при гнойно-септических заболеваниях не снижается даже с применением новейших антибиотиков, внедрением современных методик медикаментозного и хирургического лечения [3, 4].

Эндотоксин (ЭТ) грамотрицательных инфекций играет одну из ведущих ролей в формировании синдрома эндогенной интоксикации. Он обладает исключительно высокой биологической активностью и относится к числу наиболее сильных экзогенных модуляторов иммунологической реактивности. Основное патофизиологическое действие ЭТ опосредуется индукцией выброса целого ряда эндогенных медиаторов воспаления, синтезируемых в основном клетками миеломоноцитарного ряда [5].

Так, происходит связывание эндотоксина с липо­полисахаридсвязывающим протеином (Lipopoly­saccha­ride Binding Protein — LBP), который обладает высоким аффинитетом к липиду А, опосредует взаимодействие эндотоксина с мембраносвязывающим рецептором CD14 и TLR4 (toll-like receptor 4) на клетках моноцитарно-макрофагального ряда и потенцирует выработку этими клетками провоспалительных цитокинов [6, 7].

LBР имеет массу 60 kDa и связывает липиды/фосфолипиды, а также протеины с довольно широкой специфичностью. Как полагают, его первичная роль в отношении эндотоксина — связывание мономеров эндотоксина от бактериальной мембраны или от скопления циркулирующего эндотоксина с последующим взаимодействием с CD14, которое приводит к целевой клеточной активация [8, 9].

Во многих исследованиях показано, что эндотелиальные клетки испытывают недостаток в mCD14 и отвечают на эндотоксин прежде всего через растворимую форму (sCD14) этого рецептора [10].

Таким образом, к гуморальным неспецифическим механизмам индукции антиэндотоксинового иммунитета можно отнести LBP и sCD14.

К гуморальным механизмам деактивации эндотоксина можно отнести естественные антиэндотоксиновые антитела. Известно, что важную роль в клиренсе липополисахаридов (ЛПС) как непосредственно в слизистых, так и в кровотоке играют антиэндотоксиновые антитела (анти-ЭТ-АТ) [11]. Более того, антитела к консервативным частям молекулы ЭТ можно рассматривать как универсальный интегральный маркер, одновременно отражающий реакцию организма на поступление ЭТ и характеризующий врожденный и приобретенный иммунитет к грамотрицательным микроорганизмам [12, 13].

В связи с этим целью нашей работы стало изучение показателей антиэндотоксинового иммунитета у детей с гнойно-септическими заболеваниями.

Материалы и методы

Материалом для данной работы послужили наблюдения за 444 детьми с гнойно-септическими заболеваниями в возрасте от 1 года до 14 лет. Количество мальчиков, девочек и возраст в исследуемых группах больных были примерно одинаковыми.

В соответствии с клиническими диагнозами больные были разделены на группы: первую группу составили 220 детей с острой гнойной деструктивной пневмонией; вторую — 110 детей с острым гематогенным остеомиелитом; третью — 114 детей с перитонитом.

Контрольную группу составили 110 условно здоровых детей того же возраста.

Для установления диагноза пневмонии использовали протоколы диагностики и лечения в соответствии с приказом МЗ Украины № 18 от 13.01.2005 и классификацию М.Р. Рокицкого (1988) для осложненных форм пневмонии (ОГДП). Из 220 больных с ОГДП у 140 (64 %) была легочная форма пневмонии, у 80 (36 %) — легочно-плевральная. Возраст больных колебался от 1 года до 14 лет.

Больные острым гематогенным остеомиелитом были распределены следующим образом: токсическая форма выявлена у 15 (13,63 %) человек, септико-пиемическая — у 36 (32,72 %) и локальная — у 59 (53,63 %).

Согласно классификации Б.Д. Савчука, больные перитонитом были распределены на группы: местный перитонит — 70 (61,4 %), диффузный — 28 (24,56 %) и разлитой — 16 детей (14,03 %).

Уровни антиэндотоксиновых антител классов А, М, G (соответственно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [14, 15]. В качестве антигена использовали ЛПС грамотрицательной энтеробактерии Escherichia coli K30 (O9:K30:H12), выделенной из бактериальной биомассы методом водно-фенольной экстракции и дополнительно очищенной от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия). Уровни анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки крови 1 : 50 для анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и 1 : 200 — для анти-ЭТ-IgG.

Для исследования LBP и sCD14 использовали тест-системы Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HK315 и Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number: HK320 производства Hycult biotechnology (Голландия). Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационном микропланшете покрытыми антителами против LBP или sCD14. Во время инкубации LBP или sCD14 связывались с антителами, несвязанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к LBP или sCD14 добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептавидин-пероксидазный конъюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе StatFox 2100 на длине волны 450 нм [16]. Содержание LBP и sCD14 выражали в микрограммах на миллиметр.

Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный № MS0011) ДНПП ООО «Альфа» (г. Донецк).

При анализе для проверки распределения на нормальность использовали хи-квадрат и критерий W Шапиро — Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок с использованием W-критерия Вилкоксона и сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения непараметрических данных использовали ранговый однофакторный анализ Крускала — Уоллиса и критерий Данна [17].

Результаты и их обсуждение

В нашей работе для полной оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета изучали специфические (анти-ЭТ-IgA, -IgM, -IgG — приобретенный иммунитет) и неспецифические (LBP, sCD14 — врожденный иммунитет) показатели. Показатели антиэндотоксинового иммунитета представлены в табл. 1.

Статистический анализ данных табл. 1 выявил следующие закономерности. Уровень анти-ЭТ-IgG в легочной и легочно-плевральной формах был достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем. Кроме того, значения анти-ЭТ-IgG (Р > 0,05) между легочной и легочно-плевральной формами достоверно не отличались. В свою очередь, уровень анти-ЭТ-IgМ был достоверно выше (Р < 0,01) контроля, значения которого не отличались (Р > 0,05) между формами пневмонии. Для анти-ЭТ-IgА наблюдалась совершенно другая динамика: его уровень был достоверно выше (Р < 0,01) при легочно-плевральной форме по сравнению с контролем и легочной формой, а самые низкие значения анти-ЭТ-IgА были зафиксированы для легочной формы.

При анализе неспецифических показателей LBP и sCD14 (табл. 1) были получены следующие результаты: уровни LBP и sCD14 были значительно выше (Р < 0,01) контроля.

Таким образом, анализ состояния антиэндотоксинового иммунитета показал, что гнойно-деструктивная пневмония у детей вызывает дисбаланс в системах специфического (снижение анти-ЭТ-IgG) и неспеци­фического (гиперэкспрессия LBP и sCD14) звена. Очевидно, что полученные результаты связаны с этио­логией инфекционных возбудителей, при характеристике которых в ассоциации с показателями антиэндотоксинового иммунитета можно объяснить дисбаланс этого иммунного ответа.

Следующим этапом работы стал анализ состояния антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами ОГО. Результаты представлены в табл. 2.

Статистический анализ данных, представленных в табл. 2, выявил следующие закономерности для специфического (адаптивного) антиэндотоксинового иммунитета: уровень анти-ЭТ-IgG в токсической и септико-пиемической формах был достоверно ниже (Р < 0,01) контроля, а уровни этого иммуноглобулина были самыми низкими для токсической форме и при множественном статистическом анализе достоверно отличались (Р < 0,01) от септико-пиемической и локальной форм; значения анти-ЭТ-IgM были достоверно выше показателей контрольной группы только для токсической формы ОГО и достоверно не отличались для септико-пиемической и локальной форм ОГО; уровень анти-ЭТ-IgA был достоверно выше (Р < 0,01) контроля для токсической и септико-пиемической форм ОГО.

Анализ неспецифического (врожденного) звена антиэндотоксинового иммунитета (табл. 2) показал следующую картину: значения LBP и sCD14 были достоверно выше (Р < 0,01) контроля для всех форм ОГО; для токсической формы были зафиксированы самые высокие уровни данных показателей, значения которых при множественном анализе достоверно отличались от показателей септико-пиемической и локальной форм ОГО.

Таким образом, на данном этапе работы с использованием множественного статистического анализа нам удалось установить принципиально новые характеристики реагирования иммунного ответа на эндотоксин у детей с различными формами ОГО. Так, наблюдаемое нами резкое снижение концентрации специфических анти-ЭТ-IgG и возрастание анти-ЭТ-IgM, анти-ЭТ-IgA, LBP и sCD14 свидетельствует о дисрегуляции иммунного ответа, который детерминируется тяжестью состояния (наиболее значимые изменения характерны для токсической формы ОГО).

Показатели антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами перитонита представлены в табл. 3.

При анализе данных табл. 3 было выявлено, что уровень анти-ЭТ-IgG был достоверно снижен (Р < 0,01) при всех формах перитонита по сравнению с показателями контрольной группы. При множественном анализе форм перитонита было выявлено, что самые низкие значения анти-ЭТ-IgG были зафиксированы для разлитой формы по сравнению с диффузной и местной (Р < 0,01). В свою очередь, уровни анти-ЭТ-IgМ и анти-ЭТ-IgА были достоверно выше контроля (Р < 0,01) при всех формах перитонита, при этом в разлитой и диффузной форме увеличение концентрации анти-ЭТ-IgА было достоверно выше (Р < 0,01), чем при местной форме.

Показатели неспецифического антиэндотоксинового иммунитета (LBP и sCD14) были статистически значимо повышены (Р < 0,01) при всех формах перитонита. Для показателя sCD14 было установлено, что его повышение при разлитой и диффузной форме было достоверно выше (Р < 0,01), чем при местной форме.

Таким образом, анализ антиэндотоксинового иммунитета у детей с гнойно-септическими заболеваниями показал, что такие заболевания приводят к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется угнетением специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭТ-IgG) и активацией неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14). Данные изменения наиболее ярко характерны для тяжелых форм данных состояний.

Выводы

1. У детей с гнойно-деструктивной пневмонией наблюдается дисбаланс антиэндотоксинового иммунитета: уровни анти-ЭТ-IgG при легочной и легочно-плевральной формах достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем и достоверно не отличаются (Р > 0,05) между легочной и легочно-плевральной формами; уровень анти-ЭТ-IgМ достоверно выше (Р < 0,01) контроля, значения которого не отличаются (Р > 0,05) между формами пневмонии; анти-ЭТ-IgА достоверно выше (Р < 0,01) при легочно-плевральной форме по сравнению с контролем и легочной формой; уровни LBP и sCD14 значительно выше (Р < 0,01) контроля.

2. Острый гематогенный остеомиелит у детей приводит к дефициту высокоаффинных анти-ЭТ-IgG и активации неспецифических (врожденных) компонентов (LBP и sCD14), низкоаффинных анти-ЭТ-IgM, анти-ЭТ-IgA антиэндотоксинового иммунного ответа, который связан с тяжестью состояния детей.

3. Перитонит у детей приводит к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется угнетением специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭТ-IgG) и активацией неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14) с наибольшей степенью выраженности для разлитой формы перитонита.