Журнал «Здоровье ребенка» 8 (35) 2011

Сокращения: дцРНК — двухцепочечная РНК; AMП (antimicrobial peptide) — антимикробные пептиды; ERK (extracellular signal-regulated kinase) — экстрацеллюлярная сигнал-регулируемая киназа; JNK (c-Jun N-terminal kinase) — c-Jun N-терминальная киназа; HBD (human b-defensins) — человеческий b-дефензин; HD (human defensin) — человеческий a-дефензин клеток Панета; HNP (human neutrophils peptide) — человеческий нейтрофильный пептид, нейтрофильный a-дефензин; МАРК (mitogen-activated protein kinase) — митоген-активируемая протеинкиназа; MKP-1 (MAPK kinase phosphatase 1) — MAPK фосфатаза 1; MMP-1 (matrix metallopeptidase 1) — матриксная металлопротеаза 1/интерстициальная коллагеназа; NF-kB (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells) — ядерный фактор транскрипции каппа В; NLR (Nod-like receptor) — Nod-подобные рецепторы; PAMP (pathogen-associated molecular pattern) — патоген-ассоциированные молекулярные структуры; PAR (protease-activated receptor) — активируемый протеазой рецептор; TLR (Toll-like receptor) — Toll-подобные рецепторы.

Синтез и посттрансляционная модификация дефензинов

Дефензины синтезируются в виде больших прекурсорных молекул, которые состоят из 64–100 аминокислотных остатков. Препропептидные молекулы содержат сигнальный участок, который состоит в среднем из 19 аминокислотных остатков, анионный участок, включающий в себя в среднем 45 аминокислотных остатков, и регион зрелого пептида [2]. Посттрансляционная модификация дефензиновых препропептидов, которая происходит в аппарате Гольджи, характеризуется протеолитическим удалением сигнальной последовательности и последующим отщеплением определенных сегментов от N-терминального региона молекулы (рис. 1). В результате данных событий от одной материнской молекулы могут образовываться несколько молекулярных форм, которые отличаются N-терминальным регионом, что способствует увеличению разнообразия антимикробных пептидов [86]. Дальнейшее протеолитическое расщепление дефензиновых пептидов приводит к образованию фрагментов, которые обладают более мощным бактерицидным действием на инфекты и значительно меньшим токсичным влиянием на клетки макроорганизма, чем родительская молекула [229].

Локализация и индукция экспрессии дефензинов

Дефензиновые пептиды экспрессируются различными клетками человеческого организма как конститутивно, так и индуцибельно (табл. 1) [61, 73, 258].

Локализация экспрессии a-дефензинов

Человеческие миелоидные a-дефензины HNP‑1, HNP-2, HNP-3 экспрессируются нейтрофилами, незрелыми дендритными клетками моноцитарного происхождения, моноцитами, макрофагами, натуральными киллерами, gdТ-лимфоцитами, эпителиоцитами и обнаруживаются в тканях слизистой оболочки кишечника, шейки матки, плаценты; HNP-4 экспрессируются исключительно нейтрофилами. HD-5, HD-6 продуцируются клетками Панета, а HD-5 — и эпителиальными клетками вагины. Пептиды HD-5, HD-6 экспрессируются в тканях слюнных желез, в эпителии пищеварительной, мочевой систем, в слизистой оболочке глаз. Для дефензина HD-5 также характерной является экспрессия в тканях женских репродуктивных органов [207].

Локализация экспрессии b-дефензинов

Основными продуцентами b-дефензинов являются кератиноциты, эпителиоциты слизистых оболочек, макрофаги, моноциты, дендритные клетки [72, 96]. Пептиды HBD экспрессируются множеством различных эпителиоцитов, в том числе кератиноцитами, эпителиоцитами респираторного и урогенитального трактов, энтероцитами толстого кишечника, клетками роговицы, эпителиоцитами конъюнктивы. Пептиды HBD-1, HBD-2, HBD-3 также экспрессируются моноцитами, макрофагами, натуральными киллерами, дендритными клетками. Экспрессия b-дефензинов имеет тканеспецифическое распределение. Конститутивно экспрессируемый пептид HBD-1 представлен преимущественно в тканях почки и мочевыводящих путей. Пептид HBD‑2 наиболее высоко экспрессирован в эпителиоцитах кожи, респираторного тракта (трахеи, легких), слизистой оболочке желудка, крайней плоти, яичках и не встречается в тканях слюнных желез, тонкой кишки, желчевыводящих путей. HBD-3 экспрессируется в кератиноцитах, в тканях миндалин, сердца, печени и плаценты; мРНК пептида HBD-4 была обнаружена в эпителии желудка, яичках, яичниках [61, 73, 258].

Экспрессия дефензинов в ротовой полости и респираторном тракте представлена в табл. 2 [127, 137, 161, 164, 194, 201].

Индукция экспрессии дефензинов

Индуцированная продукция дефензинов обусловлена стимулирующим действием РАМР инфекционных агентов или провоспалительных цитокинов и хемокинов. Различают TLR-зависимый и TLR-независимый сигнальные пути индукции синтеза или высвобождения дефензинов [79].

TLR-зависимый путь индукции синтеза или высвобождения дефензинов

В активации высвобождения миелоидных a-дефензинов участвуют TLR2 и TLR5. Так, стимуляция мембранными липопротеинами и флагеллином Klebsiella pneumoniae TLR2 и TLR5, соответственно, CD56⁺CD3^- и CD56⁺CD3⁺ клеток приводит к активации процесса высвобождения HNP. Нейтрофилы выделяют HNP в фагосомы, а натуральные киллеры высвобождают HNP в экстрацеллюлярное пространство [79].

В активации продукции b-дефензинов участвуют TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR9. David Moranta и соавт. [153] показали, что в человеческих альвеолоцитах пептидогликаны и LPS, активируя, соответственно, TLR2 и TLR4, через фактор транскрипции AP-1 (c-Jun) сигнальный путь; а флагеллин, активируя TLR5 через JNK, p38 и ERK-сигнальные пути, индуцируют экспрессию HBD-2 и HBD-3 (рис. 2). В активации экспрессии HBD-2 принимает участие и фактор транскрипции NF-kB [153]. Активация двухцепочечной РНК (дцРНК) TLR3 первичных бронхиальных эпителиальных клеток (PBEC) индуцирует экспрессию HBD-2 и HBD-3. Взаимодействие TLR9 с бактериальной ДНК или CpG олигодеоксинуклеотидом характеризуется дозозависимой продукцией HBD-2 [79].

Однако действие РАМР одного класса, но принадлежащих разным инфекционным возбудителям, на TLR макроорганизма может сопровождаться возникновением совершенно разных, а то и противоположных эффектов. Например, LPS Porphyromonas gingivalis штамма 1690 индуцирует экспрессию мРНК HBD-1, HBD-2 и HBD-3, а LPS Porphyromonas gingivalis штамма 1435/1449 ингибирует активность экспрессии мРНК данных пептидов [56].

TLR-независимый путь индукции синтеза или высвобождения дефензинов

TLR-независимая индукция экспрессии дефензинов связана с возбуждением таких рецепторов, как NLR, PAR (protease-activated receptor — активируемый протеазой рецептор) и некоторые цитокиновые рецепторы, которые участвуют в процессе воспаления.

Возбуждение цитоплазматического рецептора NLRC2, который способен распознавать мурамилдипептид грамположительных бактерий, приводит к активации p38 и ERK MAPK, фактора транскрипции NF-kB, что индуцирует высвобождение a-дефензинов из азурофильных гранул нейтрофилов [79].

Показано, что агонисты PAR-2, но не PAR-1, индуцируют экспрессию HBD-2 в человеческих кератиноцитах. Активируемый протеазой рецептор PAR является рецептором тромбина, который относится к семейству трансмембранных G-протеин-связанных рецепторов и обладает уникальным механизмом активации. В отличие от других видов G-протеин-связанных рецепторов, возбуждение которых обусловлено взаимодействием с лигандами, активация PAR происходит путем протеолитического расщепления его N-терминального домена сериновыми протеазами: тромбином, фактором свертывания Ха, трипсином, гранзимами, плазмином, MMP-1. Некоторые бактериальные инфекционные агенты, в частности периодонтит-ассоциированный грамотрицательный патоген Porphyromonas gingivalis, продуцируют сериновые протеазы, которые способны расщеплять N-терминальнй домен PAR [79].

Некоторые цитокины (IL-1a, IL-1b, IL-2, IL‑3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8/CXCL8, IL-9, IL-10, IL‑11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, TNF‑a, IFN‑g), взаимодействуя с соответствующими рецепторами дефензин-синтезирующих клеток, активно модулируют экспрессию b-дефензинов [155, 163]. В последнее время установлено, что мощным индуктором экспрессии HBD-2 является IL-17A, активность которого превосходит более чем в 10 раз мощность наиболее сильных дефензин-стимулирующих цитокинов IL-1b и TNF-a (рис. 3) [129, 143, 196]. Семейство IL-17 насчитывает 7 цитокинов (IL‑17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E/IL-25, IL-17F), которые взаимодействуют с соответствующими рецепторами (IL-17RA, IL-17RB/IL-25R, IL-17RC, IL-17RD/SEF и IL-17RE). Провоспалительный IL‑17A (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 8 — CTLA-8) продуцируется преимущественно активированными CD45⁺RO⁺CD4⁺ Т-лимфоцитами (Th_17­-клетками), но также может быть продуцирован CD8⁺ и gdТ-клетками, дендритными клетками, эозинофилами, нейтрофилами, макрофагами, моноцитами, натуральными киллерами [82, 184]. Возбуждение рецептора IL-17RA эпителиальных и эндотелиальных клеток, фибробластов, моноцитов активирует экспрессию не только HBD-2, но и антимикробных протеинов (S100A9, S100A7, S100A8), TNF-a, интерлейкинов (IL-1b, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13), молекул адгезии (ICAM-1), хемокинов (CXCL1/Gro-a, CXCL2/Gro-b, CXCL5/RANTES, CXCL6/GCP-2, CXCL8/IL-8, CCL11/эотаксин, CCL2/MCP-1) [184, 187].

Характер цитокин-индуцибельной экспрессии дефензинов различных клеток находится в высокой зависимости от типа агониста. Jьrgen Harder и соавт. [55] было установлено, что экспрессия мРНК HBD‑2 в эпителиоцитах респираторного тракта и первичных кератиноцитах происходит при стимуляции IL-1b, TNF-a, лептином, а экспрессия мРНК HBD-3 индуцируется INF-g, TGF-a. Эталонный стимулятор форбол-миристат ацетат является сильным индуктором экспрессии генов HBD-3 и HBD-4 в человеческих первичных кератиноцитах [56, 149].

В регуляции синтеза и высвобождения дефензинов принимают участие различные внутриклеточные сигнальные пути. Например, TNF-a, IFN-g индуцируют экспрессию HBD-2 и HBD-3, активируя факторы транскрипции STAT1 и NF-kB. В то время как IL-4 и IL-13, возбуждая фактор транскрипции STAT‑6, индуцируют SOCS1 и SOCS3, которые ингибируют TNF-a/IFN-g-зависимую продукцию дефензинов [155, 163]. Однако в отсутствиe TNF-a, IFN-g интерлейкины IL-4 и IL-13 способствуют усилению экспрессии HBD-2 клетками-продуцентами, в частности эпителиоцитами трахеи [131]. В качестве примера на рис. 4 представлены сигнальные пути индукции гена DEFB4A пептида HBD-2 [79].

Трансактивация рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) также индуцирует экспрессию HBD-3 в кератиноцитах [63].

Ингибиция продукции дефензинов

Ингибирующим действием на продукцию HBD-2 [50] обладает дексаметазон, а на продукцию HBD-3 — как дексаметазон, так и конечные продукты гликозилирования [1, 104].

Ингибирующий эффект дексаметазона на IL-1b-индуцированную экспрессию мРНК HBD-2 в альвеолоцитах II порядка (A549) обусловлен его влиянием на внутриклеточные сигнальные пути. Byeong-Churl Jang и соавт. [50] установили, что дексаметазон подавляет IL-1b-индуцированную экспрессию мРНК HBD-2 в альвеолоцитах II порядка (A549) через подавление транскрипционной активности NF-kB и усиление продукции MKP-1, которая дефосфорилирует p38 МАРК.

Cheng-Che E. Lan [104] продемонстрировал ингибирующее действие высокой концентрации глюкозы на экспрессию HBD-3 в кератиноцитах. Ингибиция экспрессии HBD-3 в условиях высокой концентрации глюкозы обусловлена блокированием компонента p38 MAPK внутриклеточного сигнального пути конечными продуктами гликозилирования. Учитывая тот факт, что у экспериментальных животных с индуцированным сахарным диабетом высокая экспрессия HBD-3 способствует заживлению инфицированных Staphylococcus aureus ран, вероятно, ингибиция экспрессии HBD-3, ассоциированная с действием конечных продуктов гликозилирования, может быть одной из причин высокого риска бактериального инфицирования больных сахарным диабетом [113].

Содержание дефензинов в некоторых биологических жидкостях

Уровень концентрации миелоидных a-дефен­зинов в сыворотке крови клинически здоровых людей характеризуется достаточно высокой вариабельностью и колеблется от неопределяемых величин до 50–100 мкг/л [85]. В среднем в сыворотке крови практически здоровых людей концентрация HNP-1 составляет 31,3 мкг/л, HD-5 — 2,4 мкг/л, HD-6 — 3,1 мкг/л [20]. В бронхиальном секрете пептиды HNP-1, HNP-2, HNP-3 вместе с лизоцимом являются самыми представительными АМП, уровень их концентрации находится в пределах от 86 до 143 мкг/л [213]. В одном миллионе человеческих нейтрофилов содержится около 4–5 мг совокупной массы HNP-1, HNP-2, HNP-3 [85].

Для пептида HBD-2 характерна достаточно высокая концентрация (31,3 мкг/л), а для HBD-1 — относительно низкая (1,7 мкг/л) концентрация в сыворотке крови практически здоровых людей [181]. В состоянии относительного здоровья в слюне человека средний уровень концентраций HBD-2 и HBD-3 составляет 9,5 и 326 мкг/л, а колебания их содержания находятся в пределах 1,2–21 и 50–931 мкг/л соответственно. В общей массе белка жидкости бронхоальвеолярного лаважа содержание HBD-2 составляет 0,04 мкг/г (от 0 до 0,049 мкг/г). Причем колебания содержания HBD-2 в слюне и жидкости бронхоальвеолярного лаважа не синхронизированы. Пептид HBD-3 в бронхиальном секрете не обнаруживается [140, 201]. Susanne Schaller-Bals и соавт. [212] установили, что HBD-1 и HBD-2 присутствуют в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и у новорожденных, причем даже у недоношенных детей их концентрации эквивалентны уровням содержания этих пептидов в жидкости дыхательных путей взрослых.

Пептиды HNP-1, HD-5, HD-6 идентифицируются в молозиве и женском молоке. HBD-1 экспрессируется в эпителии молочных желез кормящих женщин, и его концентрация в грудном молоке достигает очень высокого уровня (1–10 мкг/мл) [181]. Экспрессия дефензинов идентифицируется в клетках грудного молока: HBD-1 — в 95 %, HNP-1 — в 88 %, HD-5 — в 68 %, HBD-3 — в 22 %, HBD-2 — в 15 %, HBD-4 — в 5 %, HD-6 — в 2 % клеток [20].